[发明专利]基于双模式纳米探针对钙离子进行拉曼-荧光双模式检测的方法

说明书

本发明公开了一种拉曼‑荧光双模式纳米探针，以用于检测体外及活细胞内钙离子检测或成像。所述检测方法是基于表面增强拉曼散射和荧光共振能量转移的“开‑关”转换，通过在纳米金星上组装Ca²⁺特异性的酶链及其部分互补的修饰荧光基团的底物链构建双模式纳米探针。此方法结合了SERS超灵敏性和荧光直观可视的优点，具有良好的特异性和灵敏度，在各种细胞系中具有良好的通用性。

技术领域

本发明涉及纳米材料和生命科学领域，尤其涉及一种基于双模式纳米探针对钙离子进行拉曼-荧光双模式检测的方法。

背景技术

Ca²⁺不仅在众多第二信使中处于枢纽地位，而且参与或协调其他第二信使的代谢和对细胞生理功能的调节。大量研究发现胞内Ca²⁺稳态失调是细胞凋亡中一个保守的生化事件，提示Ca²⁺参与了细胞凋亡中的信号转导过程。当细胞受到刺激时，细胞钙库Ca²⁺释放至细胞溶质，使细胞溶质内的Ca²⁺浓度增高，刺激相关通路并诱导细胞凋亡。关于Ca²⁺与细胞凋亡的关系认识也存在着许多亟待解决的问题，因此追踪细胞内Ca²⁺浓度的动态变化并了解Ca²⁺信号在细胞通路中的作用非常重要。目前，细胞内Ca²⁺浓度的测定方法包括电极法、同位素示踪法、核磁共振法、离子指示剂法、荧光指示剂法等。电极法无需指示剂，但反应速度慢而无法测定细胞Ca²⁺的快速变化，且电极刺穿胞膜将损伤细胞，同时不适用于太小的细胞。同位素示踪法，灵敏度很高，但具有一定的放射效应。核磁共振法使用时需要含氟指示剂，此法具有非破坏性和无损伤性，但测定成本高。而荧光指示剂由于其便捷和使用安全性高等特点，被广泛应用于胞内Ca²⁺的检测和成像。

刘丽娜等(光电结合检测大鼠原代神经元胞内钙离子浓度方法的建立，实验动物科学，2020，37(06):7-10)利用荧光探针fluo-4AM标记钙离子，电刺激兴奋神经元，转盘共聚焦技术检测胞内荧光强度的快速变化，从而显示胞内钙离子的浓度变化。但是，乙酰氧基甲基酯(AM)化探针容易水解，使用时需要保持干燥。在这种情况下，设计、合成新型的Ca²⁺探针具有非常重要的意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种双模式纳米探针，将荧光与SERS信号整合到同一纳米粒子上，使该粒子同时具有荧光和SERS成像能力，便可首先通过荧光信号进行快速定位和成像，再用SERS技术进行多目标跟踪和定量研究，从而能够有效解决荧光和SERS成像技术存在的问题。

本发明的一种双模式纳米探针，包括纳米金星、Ca²⁺特异性脱氧核酶、表面配体一和表面配体二，Ca²⁺特异性脱氧核酶、表面配体一和表面配体二包裹在纳米金星表面；Ca²⁺特异性脱氧核酶包括底物链和酶链，底物链和酶链部分互补，酶切位点位于底物链上，酶链可经Ca²⁺激活作用于酶切位点并切断底物链；底物链的5’端或3’端修饰荧光基团，酶链的5’端或3’端修饰巯基；表面配体一包括甲氧基聚乙二醇硫醇(SH-mPEG)、羧基聚乙二醇硫醇(SH-PEG-COOH)、氨基聚乙二醇硫醇(SH-PEG-NH₂)、聚乙二醇硫醇(SH-PEG)和牛血清白蛋白(BSA)中的一种或多种，表面配体二包括6-巯基-1-己醇(MCH)、巯基乙酸(TGA)和巯基二丁酸(MSA)中的一种或多种；酶链、表面配体一和表面配体二通过Au-S共价键与纳米金星连接。

本发明的酶链、SH-mPEG和MCH牢固地包裹在纳米金星表面，阻止纳米金星之间的相互接触和聚集，MCH小分子补充占据酶链和SH-mPEG未占据的位点，提高双模式纳米探针的稳定性。

进一步地，纳米金星、底物链、酶链、表面配体一和表面配体二的摩尔比为0.5-1.5:1600-2200:1750-2600:1000-10000:1000-10000。