[发明专利]一种高纯度的鸭肌内前体脂肪细胞分离方法

说明书

一种高纯度的鸭肌内前体脂肪细胞分离方法，属于细胞学技术领域，通过将樱桃谷鸭浸泡、放血浸泡、采集鸭胸肌组织样、清洗组织、去除筋膜、胸肌剪碎消化、终止消化、得到细胞、弃上清、吹打混匀、胸肌培养等步骤，可以快速获得大量的肌内前体脂肪细胞，突破长期以来获得该细胞难度的障碍，对研究家禽脂肪沉积及肉品质具有重要的理论价值，为开展后续实验研究奠定基础。

技术领域

本发明属于细胞学技术领域，涉及一种高纯度的鸭肌内前体脂肪细胞分离方法，具体的说是涉及一种肉鸭肌内前体脂肪细胞分离、培养及诱导分化的方法。

背景技术

脂肪含量是肉鸭重要的经济性状，肌内脂肪含量与肉的嫩度、口感和多汁性密切相关。在一定范围内，随着脂肪含量的增加，肌肉品质会不断提高；然而，家禽腹部和皮下脂肪的过度沉积，不仅会影响饲料的转化效率，还会降低胴体的经济价值。因此，提高肌内脂肪含量，降低腹部和皮下脂肪是目前育种者所追求的重要目标。

家禽的肌内脂肪与哺乳动物不同，肉眼观察不出，无法直接获得脂肪组织，且从肌肉组织中获得的脂肪细胞往往伴有肌细胞的存在，这一问题限制了体外针对肌内脂肪细胞的研究，因此，获得高纯度的鸭肌内前体脂肪细胞，对深入研究家禽肉品质具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的不足，提出一种高纯度的鸭肌内前体脂肪细胞分离方法，该方法可快速获得大量的肌内前体脂肪细胞，突破长期以来获得该细胞难度的障碍，通过检测脂肪相关关键基因的表达量，对研究家禽脂肪沉积及肉品质具有重要的理论价值。

本发明的技术方案：一种高纯度的鸭肌内前体脂肪细胞分离方法，其特征在于，所述细胞分离方法具体步骤如下：

(1)用新洁尔灭浸泡8天的樱桃谷鸭3min；

(2)肉鸭颈动脉放血死亡之后，浸泡75％酒精5min；

(3)采集鸭胸肌组织样，放入50ml的缓冲液离心管里；

(4)用缓冲液清洗组织2遍，用75％酒精浸泡1min；

(5)移到超净工作台里，再用缓冲液清洗2遍，去除筋膜；

(6)移到西林瓶里，用剪刀剪碎，胸肌用混合液消化；

(7)胶原酶消化1h(摇床，自动摇1h)，此时液体消化成糊状；

(8)用完全培养基终止消化；

(9)使用50目网筛、200目网筛和400目网筛依次过滤细胞悬液，收集到离心管里离心，1000rpm，离心10min，弃上清，此时得到的沉淀即是细胞；

(10)弃上清，向有沉淀的离心管里加入红细胞裂解液，吹打混匀，静置15min，1000rpm，离心5min，弃上清；

(11)加入完全培养基，吹打混匀，100rpm，离心5min，弃上清；

(12)再加入完全培养基吹打混匀，移到25cm²培养瓶里；

(13)利用细胞差速贴壁方法，胸肌培养1.5～2h换液，后续2～3天换一次液。

步骤(3)中所述缓冲液为2％双抗的PBS，具体为1ml双抗+49mlPBS。

步骤(6)中所述混合液为胶原酶Ⅰ+胶原酶Ⅱ按照1：1的比例混合而成，胶原酶与剪碎组织样品的体积比为4：1。

步骤(8)中所述完全培养基为5ml血清+45mlDMEM构成，其血清与DMEM的比例为1:9。