[发明专利]一种高纯度的鸭肌内前体脂肪细胞分离方法在审
| 申请号： | 202110439247.3 | 申请日： | 2021-04-23 |
| 公开（公告）号： | CN112920993A | 公开（公告）日： | 2021-06-08 |
| 发明（设计）人： | 王志秀;梁文双;田慧月;严丹;董丙强;毕瑜林;常国斌;陈国宏 | 申请（专利权）人： | 扬州大学 |
| 主分类号： | C12N5/077 | 分类号： | C12N5/077 |
| 代理公司： | 扬州苏中专利事务所(普通合伙) 32222 | 代理人： | 沈志海 |
| 地址： | 225009 *** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 纯度 鸭肌内前体 脂肪 细胞 分离 方法 | ||
1.一种高纯度的鸭肌内前体脂肪细胞分离方法，其特征在于，所述细胞分离方法具体步骤如下：
(1)用新洁尔灭清洁8天的樱桃谷鸭身体3min；
(2)肉鸭颈动脉放血死亡之后，浸泡75%酒精5min；
(3)采集鸭胸肌组织样，放入50ml的缓冲液于离心管里进行浸泡；
(4)用缓冲液清洗组织样2遍，用75%酒精浸泡1min；
(5)移到超净工作台中，再用缓冲液清洗组织样2遍，去除筋膜；
(6)把去除筋膜的胸肌组织样移入西林瓶里，用剪刀剪碎胸肌组织样；
(7)用混合液对胸肌组织样进行裂解1h（摇床，自动摇1h），裂解至糊状；
(8)用完全培养基终止消化，制成细胞悬液；
(9)依此使用50目网筛、200目网筛和400目网筛依次过滤细胞悬液，收集到离心管里离心，1000rpm/min，离心10min，弃上清，此时得到的沉淀即是细胞；
(10)先用缓冲液对步骤（9）中得到的细胞沉淀进行清洗，弃上清，对清洗过的细胞，加入红细胞裂解液，吹打混匀，静置15min，1000rpm/min，离心5min，弃上清；
(11)加入完全培养基，吹打混匀，1000rpm/min，离心5min，弃上清，得到肌内前体脂肪；
(12)用完全培养基吹打肌内前体脂肪细胞进行混匀，移到25cm2培养瓶里培养；
(13)利用细胞差速贴壁方法，于培养箱里培养肌内前体脂肪细胞1.5～2h后，更换新鲜的完全培养基，后续2～3天更换一次完全培养基。
2.一种高纯度的鸭肌内前体脂肪细胞分离方法，其特征在于：步骤(3)中所述缓冲液为2%双抗的PBS，具体为1ml双抗+49mlPBS。
3.一种高纯度的鸭肌内前体脂肪细胞分离方法，其特征在于：步骤(6)中所述混合液为胶原酶Ⅰ+胶原酶Ⅱ按照1：1的比例混合而成，胶原酶与剪碎的胸肌组织样的体积比为4：1。
4.一种高纯度的鸭肌内前体脂肪细胞分离方法，其特征在于：步骤(7)中所述摇床转速为100rpm，温度为37度。
5.一种高纯度的鸭肌内前体脂肪细胞分离方法，其特征在于：步骤(8)中所述完全培养基为5ml血清+45mlDMEM构成，其血清与DMEM的比例为1:9。
6.一种高纯度的鸭肌内前体脂肪细胞分离方法，其特征在于：步骤(10)中所述红细胞裂解液为索莱宝红细胞裂解液R1010。
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