[发明专利]新型实用的毕赤酵母分泌性表达载体、构建方法及试剂盒

说明书

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种新型实用的毕赤酵母分泌性表达载体、构建方法及试剂盒，载体骨架来源于pPICZaA，最终载体骨架仅为4K左右，便于后续的分子克隆操作实验效率。原核中筛选抗性为卡那霉素，不同于pPICZaA载体的博来霉素抗性，博来霉素价格昂贵而且在转化筛选过程中经常出现生长不均一的菌落，俗称大小斑，给克隆筛选工作带来非常大的难度。载体选用经验证能显著提高蛋白发酵表达量的突变型AOX启动子，特别是大规模发酵中能显著提高蛋白表达量。本发明的载体选用MF4I信号肽，能高效分泌表达目的蛋白，让后续分离纯化工作简单快捷，进一步节省纯化费用。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种新型实用的毕赤酵母分泌性表达载体、构建方法及试剂盒。

背景技术

目前，毕赤酵母Pichia pastoris目前已是仅次于大肠杆菌的最常用蛋白表达系统，广泛应用于实验室规模的蛋白质制备、表征以及结构解析等方面，已有上千种蛋白在毕赤酵母系统中得到成功地表达。经过这么多年的发展，毕赤酵母表达载体已经被广泛的应用于食品、医药和工业酶制剂领域，是一种非常重要的重组蛋白表达系统。毕赤酵母表达系统的优点主要包括：1.适用于清晰基因背景的多种翻译后修饰；2.在已知成分培养基中可以快速生长；3.极易使用，相比哺乳动物细胞更加便宜；4.容易进行高密度培养和发酵，表达量高。

毕赤酵母菌体内没有天然质粒存在，所以携带外源基因的重组体必须整合于染色体中才能实现外源基因的表达，可以保持基因稳定性并且可以产生多种拷贝数的基因。但是单拷贝数的重组菌株常常表达量较低，一般是通过提高外源基因在毕赤酵母中的拷贝数来提高目的蛋白的表达水平，并且使用下述3种方法：1.在表达载体中插入首尾相连的多拷贝阅读框；2.载体中插入kan基因，G418抗性水平与基因拷贝数呈线性关系；3.载体中插入Shble基因(博来霉素)，该基因在大肠和酵母中都可以表达和起生物学功能，且在酵母中抗性水平和基因拷贝数呈线性关系。

常用的多拷贝质粒是pPIC9k和pPICZa，其中pPIC9k载体带有kan基因，可以使用G418筛选，但是本身较大，有9000bp多大小，在体外进行多拷贝构建的分子生物学操作比较繁琐和不方便；而pPICZaA载体较小，只有3600bp大小，但是该载体使用的是博来霉素，博来霉素价格昂贵而且在转化筛选过程中经常出现生长不均一的菌落，俗称大小斑，给克隆筛选工作带来非常大的难度。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)现有技术中，载体骨架不便于后续的分子克隆操作实验效率。

(2)现有技术中，博来霉素价格昂贵而且在转化筛选过程中经常出现生长不均一的菌落，俗称大小斑，给克隆筛选工作带来非常大的难度。

(3)现有技术中，大规模发酵中不能显著提高蛋白表达量。

(4)现有技术中，载体不能让后续分离纯化工作简单快捷，造成纯化费用高。

解决以上问题及缺陷的难度为：

(1)寻找合适的手段将酵母载体改造成适当大小；

(2)进行载体的部分原件的有效替换，使之更利于酵母重组子的筛选和转化。

解决以上问题及缺陷的意义为：

(1)酵母载体小型化，更利于分子生物学操作；

(2)不用博来霉素，降低成本，解决大小斑问题；

(3)改变启动子强度，提高蛋白表达量；

(4)提高多拷贝载体的构建效率和成功率。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种新型实用的毕赤酵母分泌性表达载体、构建方法及试剂盒。