[发明专利]新型实用的毕赤酵母分泌性表达载体、构建方法及试剂盒

权利要求书

1.一种新型实用的毕赤酵母分泌性表达载体，其特征在于，所述新型实用的毕赤酵母分泌性表达载体的DNA的序列为SEQ ID NO：1。

2.如权利要求1所述的新型实用的毕赤酵母分泌性表达载体，其特征在于，所述SEQ IDNO：1来源于pPICZaA，片长低于4K。

3.一种卡那霉素，其特征在于，所述卡那霉素的DNA的序列为SEQ ID NO：2；所述卡那霉素为为SEQ ID NO：1中筛选。

4.如权利要求3所述的卡那霉素，其特征在于，

所述SEQ ID NO：2序列N端带上BamHI和SpeI酶切位点以及与载体骨架同源的20bp序列；序列C端带上MluI酶切位点以及以及与载体骨架同源的20bp序列；酶切位点DNA的序列为SEQ ID NO：3；

同源臂DNA的序列为SEQ ID NO：4。

5.一种BDM启动子，其特征在于，所述BDM启动子的DNA的序列为SEQ ID NO：5。

6.一种MF4I信号肽，其特征在于，所述MF4I信号肽的DNA的序列为SEQ ID NO：6。

7.一种多克隆位点区，其特征在于，所述多克隆位点区的DNA的序列为SEQ ID NO：7。

8.一种新型实用的毕赤酵母分泌性表达载体的构建的方法，其特征在于，所述新型实用的毕赤酵母分泌性表达载体的构建的方法包括：

(1)将pPICZaA载体的博来霉素抗体换成Kana霉素抗性；

(2)，Kana ORF序列与骨架载体的融合；

(3)将pPICK载体的启动子和信号肽换成BDM启动子和MF4I信号肽；

(4)Kana ORF序列与骨架载体的融合。

9.如权利要求8所述的新型实用的毕赤酵母分泌性表达载体的构建的方法，其特征在于，步骤(1)包括：

(1.1)用BamHI和MluI双酶切pPICZaA载体，得到一大小为2495bp的载体骨架，序列如SEQ ID NO：1；

(1.2)全基因合成Kana ORF序列，序列N端带上BamHI和SpeI酶切位点以及与载体骨架同源的20bp序列；序列C端带上MluI酶切位点以及以及与载体骨架同源的20bp序列。合成的Kana ORF全序列如如SEQ ID NO：2；

所述步骤(2)中片段与载体的融合利用同源重组的方法，具体方法为：回收的载体骨架100ng，回收的Kana ORF片段300ng，NEB Gibson Assembly Master Mix 5ul，总反应体系10ul，反应体系置于50℃反应1个小时后立即转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，转化子经鉴定送测，测序正确的载体保存备用；

所述步骤(3)中，pPICK载体用BglII和SalI双酶切做载体骨架，得到一大小为2810bp的载体骨架；包括SEQ ID NO：3；同源臂DNA的序列为SEQ ID NO：4；

所述步骤(4)包括：

(4.1)全基因合成BDM启动、MF4I信号肽以及MCS区域全序列，在序列C端带上与pPICK载体骨架同源的20bp序列，在序列N端同样带上与pPICK载体另一端同源的20bp序列；包括：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7；

(4.2)Kana ORF序列与骨架载体的融合，片段与载体的融合利用同源重组的方法，具体方法为：回收的pPICK载体骨架150ng，回收的BDM-MF4I-MCS片段450ng，NEB GibsonAssembly Master Mix 5ul，总反应体系10ul，反应体系置于50℃反应1个小时后立即转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，转化子经鉴定送测，测序正确的载体即为pPICK-BDM。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1～7的序列SEQ ID NO：1～SEQID NO：7。