[发明专利]一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系及其构建方法

说明书

本发明涉及一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系及其构建方法，设计靶向abhd16a基因在第三个外显子的sgRNA序列，并构建pHMG‑sgRNA‑sgabhd16a敲除表达载体；将含有靶向abhd16a基因的sgRNA表达载体通过脂质体转染至HEK293细胞，通过CTAB法提取细胞基因组扩增含有靶向sgRNA序列上下游片段，测序检测是否有基因编辑；通过嘌呤霉素筛选后，利用有限稀释法获得除abhd16a基因敲除细胞细胞株，通过免疫印迹法检测敲除细胞株中abhd16a基因敲除后蛋白表达水平。本发明通过CRISPR/Cas9构建HEK293‑ABHD16A‑/‑细胞系，为进一步研究ABHD16A功能和作用机制提供有效的工具。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系及其构建方法。

背景技术

人abhd16a又称为人类白细胞抗原-B(Human leukocyte antigen-B，HLA-B)相关转录物5(HLA-B associated transcript 5,BAT5)，属于含有α/β-水解酶结构域(Hydrolase domain containing，ABHD)家族，位于染色体6p21.33的位置，有21个外显子。研究显示ABHD家族的蛋白显示出酯酶、蛋白酶、过氧化物酶、氧化物水解酶和脱卤酶等多种酶活性，与脂代谢、细胞信号转导及多种代谢障碍等有关。人abhd16a基因编码的蛋白质又称为HLA-B相关转录物5(HLA-B associated transcript 5，BAT5)，因与肿瘤坏死因子TNFα和TNFβ、主要热休克蛋白HSP70等基因的位置靠近，都位于MHC ClassⅢ区域内，推测人abhd16a可能参与机体免疫调节。ABHD16A近年来报道研究较少并且对其功能方面的研究比较欠缺。研究显示人abhd16a可能与神经退行性疾病、免疫调节、川崎病与冠状动脉瘤有关，但具体的分子机制有待更深一步研究。为了实现abhd16a的功能和潜在的免疫调节作用的进一步研究，本发明构建了HEK293-ABHD16A-/-细胞系。

发明内容

本发明的目的是为了实现abhd16a的功能和潜在的免疫调节作用的进一步研究，本发明提供一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系及其构建方法，该方法构建的HEK293-ABHD16A-/-细胞系为进一步研究abhd16a功能和作用机制提供了有效的工具，不仅为研究其分子机制，还对发现其作为新型的药物靶标和药物发现提供重要的研究思路。

本发明为实现上述技术目的，采用的技术方案是：一种稳定敲除abhd16a基因的细胞系，所述细胞系为以具有脂代谢和机体免疫相关蛋白ABHD16A缺失的人肾胚HEK293-ABHD16A-/-细胞系。

一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系的构建方法，包括以下步骤：

1)、设计引物序列：按照CRISPR/Cas9技术的sgRNA设计原则，设计并合成sgRNA引物；

2)、pHMG-sgRNA-sgRNAabhd16a载体的构建：将sgRNA引物退火后与ddH2O、pHMG-sgRNA线性化质粒、T4DNA Ligase以及T4DNA Ligase Buffer反应，然后转化大肠杆菌DH5α感受态，挑取反应得到的阳性单菌落进行PCR扩增验证，引物为SEQ ID NO.1-2，验证完成即获得pHMG-sgRNA-sgRNAabhd16a载体；

3)、细胞培养与转染：取HEK293细胞培养并传染pHMG-sgRNA-sgRNAabhd16a载体；

4)、敲除细胞测序验证：取转染后的HEK293细胞，裂解并抽提基因组，然后按照人abhd16a基因组在敲除靶标位点上下游设计验证引物,引物为SEQ ID NO.3-4,以转染组HEK293细胞的基因组为对照组，进行PCR扩增验证，验证完成后将基因组片段回收并连接至PMD-19T，采用热激法转化DH5a感受态，采用蓝白斑筛选阳性克隆；将阳性克隆以及PCR回收产物进行测序；