[发明专利]一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系及其构建方法

权利要求书

1.一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系，其特征在于：所述细胞系为以具有脂代谢和机体免疫相关蛋白ABHD16A缺失的人肾胚HEK293-ABHD16A-/-细胞系。

2.一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)、设计引物序列：按照CRISPR/Cas9技术的sgRNA设计原则，设计并合成sgRNA引物；

2)、pHMG-sgRNA-sgRNAabhd16a载体的构建：将sgRNA引物退火后与ddH2O、pHMG-sgRNA线性化质粒、T4 DNA Ligase以及T4 DNA Ligase Buffer反应，然后转化大肠杆菌DH5α感受态，挑取反应得到的阳性单菌落进行PCR扩增验证，引物为SEQ ID NO.1-2，验证完成即获得pHMG-sgRNA-sgRNAabhd16a载体；

3)、细胞培养与转染：取HEK293细胞培养并传染pHMG-sgRNA-sgRNAabhd16a载体；

4)、敲除细胞测序验证：取转染后的HEK293细胞，裂解并抽提基因组，然后按照人abhd16a基因组在敲除靶标位点上下游设计验证引物,引物为SEQ ID NO.3-4,以转染组HEK293细胞的基因组为对照组，进行PCR扩增验证，验证完成后将基因组片段回收并连接至PMD-19T，采用热激法转化DH5a感受态，采用蓝白斑筛选阳性克隆；将阳性克隆以及PCR回收产物进行测序；

5)、敲除细胞系的筛选与检测：将测序出现基因编辑的杂合细胞中加入嘌呤霉素进行筛选，筛选后的细胞进行单克隆化，再提取单克隆化的敲除细胞的基因组，然后根据步骤4)中的方法扩增靶标序列上下游进行PCR产物回收测序；采用RAPI裂解液裂解细胞，检测HEK293细胞中ABHD16A蛋白表达情况。

3.如权利要求2所述一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤2)中sgRNA引物退火后与ddH2O、pHMG-sgRNA线性化质粒、T4DNA Ligase以及T4DNA Ligase Buffer在4℃条件下反应8-18h。

4.如权利要求2所述一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤2)中挑取阳性单菌落PCR扩增验证的反应条件为：先95℃预变性5min，然后95℃条件下反应30s，57℃条件下反应30s；72℃条件下反应20s，共进行32个循环，再在72℃条件下延伸10min，最后采用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

5.如权利要求2所述一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤3)中HEK293细胞培养和传染的具体方法为：将HEK293细胞置于含有质量浓度为10％FBS的高糖DMEM中，并置于条件为37℃、5％CO2培养箱中进行培养，转染前一天，将生长旺盛、生长状态良好的HEK293细胞铺板至24孔板中，在铺板后24h以内，采用脂质体POLOdeliverer 3000转染试剂进行转染，每孔转染1μg pHMG-sgRNA-sgRNAabhd16a载体。

6.如权利要求2所述一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤4)中抽提转染后的HEK293细胞基因组的具体方法为：取转染后的HEK293细胞，先用PBS清洗两次，然后加入0.025％的胰酶消化细胞，离心收集细胞；再向收集的细胞中加入CTAB裂解液，于65℃水浴锅温浴1h，采用酚氯仿异戊醇方法抽提基因组。

7.如权利要求2所述一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤4)中PCR扩增验证的反应条件为：先95℃预变性5min，然后95℃条件下反应30s，60℃条件下反应30s，72℃条件下反应30s，共进行32个循环，再在72℃条件下延伸10min，最后采用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

8.如权利要求2所述一种稳定敲除abhd16a基因的HEK293细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤5)中敲除细胞单克隆化的具体方法为：将测序出现基因编辑的杂合细胞中加入嘌呤霉素进行筛选，每两天更换一次含有终浓度为2ng/μL的嘌呤霉素的新鲜培养基，直至对照组未转染的HEK293细胞全部死亡；然后将筛选后的细胞采用0.025％的胰酶消化，通过有限稀释法将细胞铺板于96孔板，进行敲除细胞的单克隆化。