[发明专利]敲除或沉默猪的Kxd1基因在提高猪抗猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用

说明书

本发明属于基因工程及生物医药领域，公开了敲除或沉默猪的Kxd1基因在提高猪抗猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用，所述的Kxd1基因包括猪中的NCBI登录号为NC_010444.4的Kxd1基因或猪中与该基因同源的Kxd1基因。本发明发现该基因无论是在PK15‑CD163细胞中被敲除还是在Marc‑145细胞中被敲低之后都能够抑制PRRSV的增殖，故本基因可作为抑制PRRSV复制的疫苗药物的开发与抗病育种研究的新型靶点。

技术领域

本发明属于基因工程及生物医药领域，具体涉及敲除或沉默猪的Kxd1基因在提高猪抗猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，简称PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus，简称PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍、仔猪呼吸系统疾病和高死亡率为主要临床特征的重大病毒性传染病(Chand et al 2012；Van 1997)。自1987年首次在美国爆发以来，已成为影响全球养猪业发展的重要疾病(Keffaber et al 1989)。虽然目前已培育出PRRSV受体CD163基因缺失的抗PRRS的基因编辑猪(Burkardet al 2017；Whitworth et al 2015；Yanget al2018)，但仍存在基因编辑动物的生物安全、PRRSV变异较快、病毒与宿主(猪)互作机理不完全清楚以及可用于抗病育种的靶基因缺乏等问题，严重制约了靶向药物的开发及抗病育种的进程。

发明内容

本发明的目的在于提供了敲除或沉默猪的Kxd1基因在提高猪抗猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用，所述的Kxd1基因包括猪中的NCBI登录号为NC_010444.4的Kxd1基因或猪中与该基因同源的基因。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

抑制猪Kxd1基因表达的制剂在制备抗PRRSV感染药物中的应用；所述的Kxd1基因包括猪中的NCBI登录号为NC_010444.4的Kxd1基因或猪中与该基因同源的Kxd1基因，例如绿猴的Kxd1基因，绿猴Kxd1基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。

以上所述的应用中，优选的，所述的抑制方法包括但不限于针对猪Kxd1基因的CRISPR/Cas9敲除技术、siRNA干扰技术。

本发明的保护内容还包括：通过敲除或者沉默猪Kxd1基因来制备抗PRRSV感染的细胞模型。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

申请人分别通过CRISPR敲除及基因干扰技术在PK15-CD163、Marc-145细胞中靶向敲除/抑制Kxd1的表达，首次发现敲除/抑制Kxd1的表达的细胞可以通过影响PRRSV的复制从而抵抗PRRSV的感染，该基因可作为PRRSV的新型抗病靶点。本发明为研制有效安全防治PRRS的新型疫苗药物提供了新的靶标，也为抗PRRS育种研究提供了新型候选基因，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1：PK15-Cas9-CD163单克隆细胞系的构建及验证；

其中：(A)扩增猪CD163基因的CDS序列；

(B)Western Blot检测PK15-Cas9-CD163细胞中CD163蛋白的表达；

(C)RT-PCR检测NSP2在PRRSV感染48h后的转录，泳道1：Marc145细胞(PRRSV感染)；2：Marc45细胞(未感染PRRSV)；3：PK15-Cas9-CD16细胞(PRRSV感染)；4：PK15-Cas9-CD163细胞(未感染PRRSV)；