[发明专利]一种三叶斑潜蝇热休克转录因子蛋白原核表达的方法

说明书

本发明公开了一种三叶斑潜蝇热休克转录因子蛋白原核表达的方法，包括蛋白表达载体构建和原核表达载体的诱导表达两个部分，具体为：设计带有特定酶切位点(BamHI和XhoI)的特异性引物并进行目的片段的扩增。将PCR产物回收、克隆并在测序正确之后进行提取质粒。原核表达载体的构建酶切。表达菌的制备。诱导表达最佳条件摸索。目的蛋白表达形式及Western blot鉴定。本实验不仅摸索出了提高三叶斑潜蝇热休克转录因子蛋白原核表达水平的最佳IPTG浓度，提高了实验效率和效果，而且对我们系统全面研究整个Hsp家族基因转录调控机制，及其在斑潜蝇温度耐受性和入侵传播中的功能具有重要的意义。

技术领域

本发明涉及生物技术，特别涉及一种三叶斑潜蝇热休克转录因子蛋白原核表达的方法。

背景技术

斑潜蝇种类繁多，种间竞争与替代迅速。三叶斑潜蝇Liriomyza trifolii，美洲斑潜蝇L.sativae和南美斑潜蝇L.huidobrensis是危害严重的三种多食性斑潜蝇。尽管三种近缘斑潜蝇有着相似的形态特性和重叠的生态位，但三叶斑潜蝇与其近缘种相比却拥有更强的入侵和竞争能力。温度是影响入侵性斑潜蝇种间竞争取代的重要因子。斑潜蝇在入侵扩散的过程中产生了相应的对抗极端温度的耐受能力以适应环境的变化，但目前对其内在分子机制和相关基因调控的研究甚少。

热激响应(HSR，heat shock response)是一种高度保守的防御机制，能够由热胁迫或其他环境和生理胁迫迅速诱导，清除在细胞质和细胞核中出现的错误折叠或者损坏的蛋白质。HSR的主要调控因子是热休克转录因子(Hsf，heat shock transcriptionfactor)。HSF的转录活化是一个多步骤的过程，在未激活的状态下，HSF一般以单体的形式与分子伴侣(热激蛋白HSPs，heat shock proteins)结合停留在细胞质或细胞核中，当受到热胁迫或者其他环境胁迫造成细胞内蛋白质大量错误折叠和沉积时，HSF与分子伴侣HSPs分离，以三聚体的形式与相邻的启动子区的热休克元件(HSEs，heat shock elements)结合，这些HSEs位于编码其他HSPs基因的启动子区域，能够调控大量HSPs的转录表达。虽然关于三叶斑潜蝇中热激蛋白的表达有了一些研究，但关于这些热激蛋白的调控机制研究目前来说还是空白。

在斑潜蝇的入侵传播和与近缘种竞争中，热激蛋白的差异表达在其中可能起着重要的作用。因此在入侵性三叶斑潜蝇中搞清楚热休克转录因子HSF如何调控sHSPs的表达来应对温度胁迫的研究具有十分重要的意义。

发明内容

发明目的：本发明目的是提供一种三叶斑潜蝇热休克转录因子蛋白原核表达的方法，建立了重组蛋白Hsf1的最佳培养体系，包括蛋白表达载体以及构建原核表达载体的诱导表达两个部分。

技术方案：本发明提供一种三叶斑潜蝇热休克转录因子蛋白原核表达的方法，包括如下步骤：

a、蛋白表达载体构建：

(1)对从三叶斑潜蝇高低温处理转录组中(PRJNA575513)获得的三叶斑潜蝇Hsf基因的开放阅读框(ORF)进行分析，设计带有特定酶切位点，BamHI和XhoI的特异性引物并进行目的片段的扩增，Hsf基因序列为SEQ ID NO.1；

(2)将PCR产物回收、克隆并在测序正确之后进行提取质粒；

(3)原核表达载体的构建酶切，带有目的基因的阳性克隆重组子质粒和原核表达载体质粒(pET28a)分别进行双酶切，使用T4 DNA连接酶进行连接，连接后将重组质粒继续转化至DH5α中，再次提取质粒用于后续实验，

b、原核表达载体的诱导表达：

(4)表达菌的制备：构建的原核表达载体质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，转化后菌液涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基平板中培养，挑取菌落到含卡那霉素的LB液体培养基中，振荡培养，以此菌液作为PCR模板进行菌液PCR验证所挑单克隆正确性；