[发明专利]一种三叶斑潜蝇热休克转录因子蛋白原核表达的方法

权利要求书

1.一种三叶斑潜蝇热休克转录因子蛋白原核表达的方法，其特征在于：包括如下步骤：

a、蛋白表达载体构建：

(1)对从三叶斑潜蝇高低温处理转录组中(PRJNA575513)获得的三叶斑潜蝇Hsf基因的开放阅读框(ORF)进行分析，设计带有特定酶切位点，BamHI和XhoI的特异性引物并进行目的片段的扩增，Hsf基因序列为SEQ ID NO.1；

(2)将PCR产物回收、克隆并在测序正确之后进行提取质粒；

(3)原核表达载体的构建酶切，带有目的基因的阳性克隆重组子质粒和原核表达载体质粒(pET28a)分别进行双酶切，使用T4 DNA连接酶进行连接，连接后将重组质粒继续转化至DH5α中，再次提取质粒用于后续实验，

b、原核表达载体的诱导表达：

(4)表达菌的制备：构建的原核表达载体质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，转化后菌液涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基平板中培养，挑取菌落到含卡那霉素的LB液体培养基中，振荡培养，以此菌液作为PCR模板进行菌液PCR验证所挑单克隆正确性；

(5)诱导表达最佳条件摸索：将上述验证正确的菌液接入含卡那霉素的LB液体培养基中，振荡培养，加入不同浓度的IPTG诱导表达，并继续振荡培养；

(6)目的蛋白表达形式及Westernblot鉴定。

2.根据权利要求1所述的三叶斑潜蝇热休克转录因子蛋白原核表达的方法，其特征在于：所述步骤(6)的方法为：取诱导后的菌液，加入Ni-NTA琼脂糖填料蛋白结合/清洗缓冲液，超声波破碎，离心，保留上清和沉淀，按照TGXTM FastCastTM丙烯酰胺溶液配制2块凝胶，将重组蛋白上清液和沉淀液与上样缓冲液混合均匀，煮沸，使蛋白质变性，电泳结束后对其中一块胶用考马斯亮蓝对凝胶进行染色，同时另取一块凝胶，转置PVDF膜上，转膜结束后加入稀释的抗His单克隆抗体，孵育，取出PVDF膜，漂洗，加入稀释的山羊抗小鼠lgG HRP，孵育，取出PVDF膜，漂洗后，ECL显色拍照。

3.根据权利要求1所述的三叶斑潜蝇热休克转录因子蛋白原核表达的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的特异性引物分别为：

BamHI-F：cggatccatgcacacattcagtgaaac；

Xhol-R：ccgctcgagttaaaaaaaagtagaagaag。

4.根据权利要求1所述的三叶斑潜蝇热休克转录因子蛋白原核表达的方法，其特征在于：所述步骤(5)中IPTG的浓度范围为0-1.0mM。

5.根据权利要求1所述的三叶斑潜蝇热休克转录因子蛋白原核表达的方法，其特征在于：所述步骤(5)中最佳条件为16℃和0.25mmol IPTG浓度，诱导表达24小时。