[发明专利]一种免疫细胞体外诱导扩增、冻存和复苏的方法

说明书

本发明提供一种免疫细胞体外诱导扩增、冻存和复苏的方法，涉及免疫细胞体外扩增技术领域。所述免疫细胞体外诱导扩增、冻存和复苏的方法主要包括免疫细胞激活培养基对单个核细胞的激活培养、初步扩增培养基的初步诱导扩增培养、二次扩增培养基的二次扩增培养、冻存液冻存处理、冻存液混合解冻。本发明克服了现有技术的不足，有效提高了免疫细胞的诱导效率，且体外扩增速度快，安全性高，使细胞在长期保存后仍具有良好的细胞特性。

技术领域

本发明涉及免疫细胞体外扩增技术领域，具体涉及一种免疫细胞体外诱导扩增、冻存和复苏的方法。

背景技术

癌症是现代社会中对人类威胁最大的疾病之一，对癌症的治疗一直是现代医学的关注点。肿瘤免疫治疗被国内外医学界公认为第四大肿瘤治疗法，其中自体免疫细胞(T细胞、NK细胞)治疗技术属国家卫生部首批允许临床应用的第三类医疗技术。近年来，自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)免疫治疗技术在世界范围内正在成为一种可靠的抗癌疗法，适用于多种恶性肿瘤的临床治疗且副作用小，不损伤正常组织。NK细胞于20世纪70年代进入人们的视线，至今已有近40年的发展历史。NK细胞被定义为大颗粒淋巴细胞(LGL)，是由淋巴祖细胞分化而来，并与B淋巴细胞和T淋巴细胞构成了三大类免疫细胞。NK细胞无需预先接触抗原即可杀伤靶细胞(如病毒感染的宿主细胞和肿瘤细胞)，由于NK细胞的杀伤活性无MHC限制，因此称为自然杀伤活性，其在免疫监视和早期抗感染免疫过程中起重要作用。

NK细胞主要来源于骨髓CD34+的淋巴细胞，分布在骨髓、外周血和脾脏，占外周血淋巴细胞的10％-20％。NK细胞在肿瘤免疫、清除非己细胞等方面发挥重要作用：它是天然免疫防御的主要组成，位于机体防御体系的第一道防线，NK细胞的杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，可无需抗原预先致敏即可识别并杀死肿瘤及病毒感染的细胞，通过穿孔素-颗粒酶途径和Fas-FasL通路直接对肿瘤细胞发挥细胞毒作用杀伤肿瘤细胞；同时它又能在发病早期分泌多种细胞因子和趋化因子如TNF-α、IFN-γ和IL-1等，这些细胞因子参与抗癌和调节获得性免疫应答，故NK细胞也是连接天然免疫与获得性免疫的桥梁。虽然NK细胞的抗癌效果的安全性和疗效得到肯定，但由于它仅占外周血淋巴细胞的10％-20％，因而如何获得高纯度、高质量地NK细胞产品是NK治疗的关键。

然而现有的NK细胞体外培养问题主要在于NK细胞体外扩增速度慢，同时还有大量的T细胞混杂，而且培育出的NK细胞性能较差，生物活性不足，申请号为CN201611233042.5的“一种免疫细胞体外诱导扩增的方法”，通过在培养基中添加白介素-2等物质提升免疫细胞的诱导效率和扩增效率，但是在实际生产过程中细胞的生长效率依然较低，生产成本也较高。

发明内容

针对现有技术不足，本发明提供一种免疫细胞体外诱导扩增、冻存和复苏的方法，有效提高了免疫细胞的诱导效率，且体外扩增速度快，安全性高，使细胞在长期保存后仍具有良好的细胞特性。

为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：

一种免疫细胞体外诱导扩增、冻存和复苏的方法，所述一种免疫细胞体外诱导扩增、冻存和复苏的方法包括以下步骤：

(1)培养容器包被处理：将CD16抗体包被培养容器，获取包被后的培养容器备用；

(2)单个核细胞激活培养：采用免疫细胞激活培养基，将单个核细胞置于上述步骤(1)中包被后的培养容器中，进行激活培养24-36h，得激活细胞备用，其中免疫细胞激活培养基包括无血清淋巴细胞培养基、自体血浆、IL-2、γ干扰素和沙培林；

(3)初步诱导扩增：采用初步扩增培养基对上述激活细胞进行初步扩增培养，且在培养过程中向培养基中加入EPO，其中初步扩增培养基包括无血清淋巴细胞培养基、自体血浆、IL-10；