[发明专利]一种免疫细胞体外诱导扩增、冻存和复苏的方法

权利要求书

1.一种免疫细胞体外诱导扩增、冻存和复苏的方法，其特征在于，所述一种免疫细胞体外诱导扩增、冻存和复苏的方法包括以下步骤：

(1)培养容器包被处理：将CD16抗体包被培养容器，获取包被后的培养容器备用；

(2)单个核细胞激活培养：采用免疫细胞激活培养基，将单个核细胞置于上述步骤(1)中包被后的培养容器中，进行激活培养24-36h，得激活细胞备用，其中免疫细胞激活培养基包括无血清淋巴细胞培养基、自体血浆、IL-2、γ干扰素和沙培林；

(3)初步诱导扩增：采用初步扩增培养基对上述激活细胞进行初步扩增培养，且在培养过程中向培养基中加入EPO，其中初步扩增培养基包括无血清淋巴细胞培养基、自体血浆、IL-10；

(4)二次扩增：采用二次扩增培养基将上述初步扩增后的免疫细胞进行二次扩增，且在扩增过程中向培养基中加入IL-2，其中二次扩增培养基包括无血清淋巴细胞培养基、自体血浆、甲状旁腺激素，二次扩增结束后得大量激活免疫细胞；

(5)冷冻处理：将上述激活免疫细胞采用冻存液进行冻存，得冻存免疫细胞；

(6)细胞复苏：将上述冻存免疫细胞加入温度为40-45℃的冻存液混合搅拌溶解，溶解后对溶液进行离心，得复苏的免疫细胞。

2.根据权利要求1所述的一种免疫细胞体外诱导扩增、冻存和复苏的方法，其特征在于：所述步骤(2)中免疫细胞激活培养基中自体血浆的含量为7体积％-13体积％、IL-2浓度为700-1300IU/ml、γ干扰素的浓度为300-400U/mL、沙培林浓度为0.007-0.013KE/ml。

3.根据权利要求1所述的一种免疫细胞体外诱导扩增、冻存和复苏的方法，其特征在于：所述步骤(3)中初步扩增培养基中自体血浆的含量为15体积％-22体积％、IL-10的含量为500-1000U/ml。

4.根据权利要求1所述的一种免疫细胞体外诱导扩增、冻存和复苏的方法，其特征在于：所述步骤(3)中EPO的添加量为1.2-2.0ng/ml，且EPO在初步诱导扩增2h后添加。

5.根据权利要求1所述的一种免疫细胞体外诱导扩增、冻存和复苏的方法，其特征在于：所述步骤(4)中二次扩增培养基中自体血浆的含量为20体积％-24体积％、甲状旁腺激素的含量为0.52-0.78ug/ml。

6.根据权利要求1所述的一种免疫细胞体外诱导扩增、冻存和复苏的方法，其特征在于：所述步骤(4)中IL-2的添加量为500-600IU/ml，且IL-2在二次扩增2h后添加。

7.根据权利要求1所述的一种免疫细胞体外诱导扩增、冻存和复苏的方法，其特征在于：所述步骤(5)中冻存液包含5-8％的DMSO、1-2％的HSA、10-15％的自体血浆、1-2％氨基乙醇，余量为无血清淋巴细胞培养基。

8.根据权利要求1所述的一种免疫细胞体外诱导扩增、冻存和复苏的方法，其特征在于：当所述分化的免疫细胞的CD56的表达超过90％时，进行步骤(4)中的二次扩增。

9.根据权利要求1所述的一种免疫细胞体外诱导扩增、冻存和复苏的方法，其特征在于：所述免疫细胞为自然杀伤细胞。