[发明专利]一种玉米基因ZmNAC7的克隆方法、应用及应用方法

说明书

本发明专利属于玉米基因克隆领域，是对玉米NAC7基因克隆方法、应用及应用方法。包括以下步骤：材料的准备与处理、玉米叶片总RNA的提取、反转录成cDNA及实时荧光定量PCR(RT‑PCR)、回收并纯化扩增产物中的目的片段并测序鉴定；同时公开了其应用方法：包括pMD19‑T‑ZmNAC7重组质粒的构建、植物表达载体pCambia1300‑ZmNAC7的构建、菌液PCR及酶切鉴定、农杆菌感受态细胞制备、转ZmNAC7基因的拟南芥植株，利用转化植株研究玉米基因ZmNAC7的功能。本发明研究的是玉米ZmNAC7基因的克隆方法、应用及应用方法，为玉米ZmNAC7基因功能的研究奠定了基础，对培育抗茎腐病新品种有着重要的实际意义。

技术领域

本发明属于玉米基因克隆技术领域，具体涉及一种玉米基因ZmNAC7的克隆方法、应用及应用方法

背景技术

NAC是植物中第二大类转录因子家族，也是植物所特有的转录因子，在玉米中，共发现190个NAC家族蛋白成员。NAC家族蛋白在植物的生长发育和胁迫应答过程中发挥着重要作用。NAC转录因子的启动子上含有多个响应激素信号通路和逆境胁迫的元件，这些元件也表明NAC转录因子是参与调控植物的生物与非生物胁迫反应的重要因子。NAC转录因子受生物或非生物胁迫的诱导表达后能够增强植物的抗病能力，同时NAC转录因子可以响应相应盐胁迫、干旱胁迫、及温度胁迫的反应。

茎腐病目前是影响全世界玉米产量及品质的一个重要因素，在茎腐病发病严重的区域甚至会造成玉米产量为零；干旱可以直接或者间接地改变土壤菌落成分，并进一步对植物功能产生影响。植物受到干旱胁迫时，其生长发育、激素代谢、保护酶系统等各种生理活动都会受到严重影响。目前，在玉米茎腐病的防治上采用较多的仍然是药剂防治的方法，但是对人体健康和生态环境造成很大的危害，因此选育和种植玉米抗病品种非常重要。

作为人们主要的粮食作物及饲料来源之一的玉米，因其广泛的应用价值及低廉的成本，一直受到世界各国学者的重视和青睐。在我国，玉米已成为三大作物中总产量最高、种植面积最大、单产仅次于水稻的重要作物。因此选育玉米抗茎腐病品种，及通过基因克隆方法培育抗茎腐病品种尤为重要。所以通过研究部分NAC基因对植物的抗病性，为我们研究抗性品种、改良作物提供了新的方向。

发明内容

本发明属于玉米基因克隆技术领域，具体涉及一种玉米基因ZmNAC7的克隆方法、应用及应用方法，可以有效克隆和表达玉米ZmNAC7基因，提供了玉米ZmNAC7基因的克隆在研究植物抗旱及玉米茎腐病的抗病机制和遗传改良中的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

本发明所述的玉米基因ZmNAC7的克隆方法，包括如下步骤：

(1)材料的准备与处理；

(2)玉米叶片的总RNA的提取，反转录成cDNA；

(3)以cDNA为模板，设计特异性引物，通过PCR扩增基因NAC7的编码区序列，其中，PCR扩增所用的引物如下：

ZmNAC7正向引物(F)：

5’-ATGGACACTTTCTCTCATGTCCCCCCTG-3’；

ZmNAC7反向引物(R)：

5’-CTATTTCCACATGTTCGCCTCGC-3’；

PCR扩增体系为：2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)25μl、Zm-NAC7-F 2μl、Zm-NAC7-R 2μl、cDNA 1μl、RNase free water 20μl；

PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环,4℃保存；

(4)回收并纯化步骤(3)的扩增产物中的片段并测序，测序正确的即为玉米基因NAC7编码序列的克隆；