[发明专利]一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法及应用，RNA疫苗的制备；DC细胞的培养和电转；DC细胞和T细胞的共孵育；41BB筛选T细胞，IL‑2、IL‑7、OKT3扩增T细胞。本发明使用pcDNA3.1+质粒，构建体外表达载体，相对于传统的多肽合成，制备周期短、成本低、制备成功率高；使用电转仪进行电转。相对于传统转染方式，重复性好，无试剂费用，电转率高；使用RNA疫苗电转DC细胞，相比于其他生物治疗，易在体外生产和纯化，生产工艺通用性强，安全性高；将电转后的DC细胞和T细胞共培养，使用41BB对T细胞进行筛选，获得的活化的NRT疫苗比例高，免疫原性强；IL‑2、IL‑7、OKT3扩增T细胞，获得的细胞数量多，培养效果好；整个过程不使用血清，获得的细胞安全性高。

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法及应用。

背景技术

我国恶性肿瘤发病率整体呈现上升的态势,恶性肿瘤是我国居民第一大致死因素，2018年我国城市居民恶性肿瘤死亡率为163.18/10万，农村居民恶性肿瘤死亡率为158.61/10万。目前，临床上以手术、放疗、化疗为主的综合治疗效果并不理想，近年来分子靶向治疗的广泛应用虽显著改善了部分恶性肿瘤的预后，但靶向治疗主要针对EGFR、ALK等突变的人群，其获益人群少且最终均面临耐药性的问题。大多数恶性肿瘤患者并不存在这些致癌基因突变，治疗手段仍以传统放化疗为主，预后不佳。因此，新的恶性肿瘤治疗手段研究迫在眉睫。

随着肿瘤免疫学和临床免疫治疗应用的深入，肿瘤免疫治疗正成为继手术、放疗、化疗、靶向治疗之后的一种常规治疗手段。肿瘤免疫治疗是近年来肿瘤治疗领域的研究热点。2013年，肿瘤的免疫治疗被《Science》杂志评为年度十大科学突破之首。2016年，美国临床肿瘤学会(ASCO)宣布免疫治疗为年度肿瘤研究的首要进展。肿瘤新生抗原(neoantigens)是肿瘤细胞由于基因变异而产生的特异存在于肿瘤细胞中的多肽或者蛋白，其上面载有的一些新生抗原表位能被免疫系统识别，从而精准地攻击肿瘤细胞。以肿瘤新生抗原为靶点的治疗，相较于传统的肿瘤相关抗原治疗具有特异性强、对正常组织伤害小、自身免疫概率低、可多靶点同时进行治疗等优点，能够特异性激活细胞毒性T细胞，实现对肿瘤细胞的杀伤。

研究表明，基于肿瘤新生抗原的治疗通过激活和提高受试者体内新生抗原特异性T细胞的比例及活性，靶向杀伤受试者的肿瘤组织。2017年7月，《nature》上同日刊登两篇以新生抗原为靶点成功治疗晚期黑色素瘤的临床研究，力挺基于新生抗原的个体化肿瘤治疗模式。其中，Ugur Sahin的研究团队纳入13例晚期黑色素瘤受试者，经治疗后8人肿瘤完全消失；Patrick的研究团队纳入6名受试者，经治疗后4人肿瘤完全消失，在32个月内没有复发，另外两人在接受PD-1辅助治疗后肿瘤也完全消失。与此同时，基于新生抗原的精准免疫治疗在一些实体瘤如胆管癌和结直肠癌中也展现出惊人的疗效。

新生抗原反应性T细胞(Neoantigen Reactive T lymphocyte，NRT)是指对患者本人突变性新抗原表位有反应的特异性免疫细胞，其对表达相应新抗原的肿瘤细胞具有免疫杀伤效应。被誉为过继性T细胞治疗之父的Steve Rosenberg教授及其研究团队，在2013年率先采用外显子测序技术鉴别在患者中表达的突变蛋白，再使用计算机模拟等技术鉴别出在患者肿瘤细胞上表达，能被肿瘤浸润淋巴细胞识别的突变抗原表位。2014年，Rosenberg团队将该技术成功应用于临床，对一位肺、肝等多处癌转移且放化疗均告失败的晚期胆管癌受试者的肿瘤组织进行测序并鉴定出新生抗原，随后分离出新生抗原特异性T淋巴细胞回输入受试者体内，发现受试者在治疗的两年期间，肿瘤明显缩小，病情稳定(一般晚期胆管癌的平均生存期不超过10个月)。相关文章发表在当年的《SCIENCE》杂志上，引起了学术界的轰动。随后，《NEJM》又报道该研究团队利用同样的过继性T细胞疗法成功治疗了一位晚期转移性结直肠癌的受试者。2019年南京鼓楼医院的刘宝瑞教授及其团队有研究者在JCI发表了NRT治疗晚期胸腺瘤和晚期胰腺癌所取得的可喜成绩。