[发明专利]一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法及应用在审
申请号: | 202110416446.2 | 申请日: | 2021-04-19 |
公开(公告)号: | CN113322233A | 公开(公告)日: | 2021-08-31 |
发明(设计)人: | 苏小平;李锐;李伟迎;张齐 | 申请(专利权)人: | 格源致善(上海)生物科技有限公司 |
主分类号: | C12N5/0783 | 分类号: | C12N5/0783;C12N15/85;C12N15/12;C12N5/10;A61K39/00;A61P35/00 |
代理公司: | 上海愉腾专利代理事务所(普通合伙) 31306 | 代理人: | 唐海波 |
地址: | 200233 上海市徐*** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 改进 基于 新生 抗原 反应 细胞 制备 方法 应用 | ||
1.一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
基于肿瘤标本获得肿瘤基因突变;
根据基因突变分析肿瘤新生抗原;
根据新生抗原构建体外表达载体,制备RNA疫苗;
基于外周血单个核细胞获得T细胞和电转RNA疫苗的DC细胞;
由T细胞和电转RNA疫苗的DC细胞,诱导生成新生抗原反应性T细胞;
使用41BB抗体对诱导生成的新生抗原反应性T细胞进行筛选,并将筛选后的细胞扩增培养,得到基于新生抗原反应性T细胞。
2.根据权利要求1所述的一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法,其特征在于:所述基于肿瘤标本获得肿瘤基因突变的步骤中,所述肿瘤基因突变是通过基因测序分析得到的。
3.根据权利要求1所述的一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法,其特征在于:所述根据新生抗原构建体外表达载体,制备RNA疫苗的步骤中,所述表达载体依次进行质粒线性化和体外转录,制备RNA疫苗。
4.根据权利要求1所述的一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法,其特征在于:所述基于外周血单个核细胞获得T细胞和电转RNA疫苗的DC细胞的步骤中,所述外周血单个核细胞经分离、培养和电转获得T细胞和电转RNA疫苗的DC细胞。
5.根据权利要求1所述的一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法,其特征在于:所述由T细胞和电转RNA疫苗的DC细胞,诱导生成新生抗原反应性T细胞的步骤中,所述电转RNA疫苗的DC细胞诱导T细胞的活化,制备新生抗原反应性T细胞。
6.根据权利要求1所述的一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法,其特征在于:所述使用41BB抗体对诱导生成的新生抗原反应性T细胞进行筛选,并将筛选后的细胞扩增培养,得到基于新生抗原反应性T细胞的步骤中,所述细胞扩增培养是采用IL-2、IL-7、OKT3进行扩增的。
7.根据权利要求3所述的一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法,其特征在于:所述表达载体为pcDNATM6、pcDNATM5、pCEP4、pcDNA3.1的任意一种。
8.根据权利要求1至7任一所述的一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法,其特征在于:包括以下具体步骤:
采集患者肿瘤组织和对照组织标本,依次进行基因测序和生信分析基因突变;
根据基因突变分析肿瘤新生抗原;
根据肿瘤新生抗原构建体外表达载体,所述表达载体依次进行质粒线性化、体外转录和纯化,制备RNA疫苗;
单采机采集患者外周血单个核细胞,采用Ficoll-Histopaque分离外周血单个核细胞,贴壁一定时间,将T细胞冻存备用,DC细胞加入DC培养液,吸取DC培养液的上清液,经离心去除一半体积的培养基,加入相应体积的新鲜培养基、细胞因子和诱导试剂,诱导DC细胞成熟,收集诱导成熟的DC细胞,用RNA疫苗电转DC细胞,获得T细胞和电转RNA疫苗的DC细胞;
复苏冻存的T细胞,将电转RNA疫苗的DC细胞洗涤并按比例加入到T细胞中,过夜孵育后加入41BB抗体,得到细胞混合液,将细胞混合液放入含有IL-2和IL-7的培养袋中诱导培养,在诱导培养后的细胞混合液中加入IL-2、IL-7和OKT3并更换孔板继续培养,进行二次诱导培养,得到基于新生抗原反应性T细胞。
9.一种如权利要求1至8任一所述的一种改进的基于新生抗原反应性T细胞的制备方法制备的基于新生抗原反应性T细胞。
10.一种如权利要求9所述的一种基于新生抗原反应性T细胞在肿瘤免疫治疗中的应用。
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