[发明专利]一种分析松材线虫种群遗传多样性的方法

说明书

本发明公开了一种分析松材线虫种群遗传多样性的方法，先收集来自于不同地理位置的松材线虫虫株，提取其DNA并进行高通量测序；利用自主参与编写的生物信息学软件分析全基因组信息，得到各种SNPs数据及基因型类型，获知松材线虫体内SNPs位点分布情况，进行聚类分析，筛选获得特异性SNP位点。本申请通过聚类分析可将这各虫株分为三类：其中四川省虫株单独聚为A类，广东省有两株虫株分为B类，其余6株虫株分为C类。并且焦磷酸测序结果显示GD位点可将C类虫株与其他两类分开。广东省和四川省松材线虫遗传多样性较高；为推测松材线虫病的传播途径提供了理论基础。

技术领域

本发明属于遗传多样性分析技术领域，具体涉及一种分析松材线虫种群遗传多样性的方法。

背景技术

松材线虫病(Bursaphelenchus xylophilus)是林业最具破坏性的病害之一，严重破坏生态系统且造成巨大的经济损失。由于该病害具有死亡率高及难以防治等特点，被称为“松树的癌症”，全球已有52个国家将其作为检疫性病害。而我国自1982年在南京中山陵首次发现后，迅速蔓延，至2018年，已扩散至16个省(市)，316个县区。

在松材线虫病的防治上，我国主要贯彻“以防为主，防治并举，防重于治”的方针。目前，我国主要通过检验检疫及消灭传播媒介等方法来防止松材线虫病向外传播蔓延，但由于技术等原因，很难彻底阻断传播，且一旦产生新疫点，无法确定其传播来源，从而无法制定针对性的政策。

研究物种的种群遗传多样性可以在分子水平上揭示物种亲缘关系，揭示物种的来源。目前，已经应用了RAPD、ISSR等分子标记技术来研究松材线虫和拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)的种内及种间遗传变异性，但都只能将松材线虫与拟松材线虫区分开，并不能说明松材线虫种内的差异性。SNP(single nucleotidepolymorphisms)即单核苷酸多态性，主要是指由于单个核苷酸的变异而引起基因组水平上的DNA序列多态性，包括单碱基的缺失、插入、转换及颠换；SNP分子标记技术作为最具前景的分子标记技术被广泛应用于分子遗传学等方面，且新一代测序技术的开发，大大提高了SNP的准确度和丰度，使利用SNP分子标记方法更为便捷。

目前，SNP分子标记方法在中国松材线虫种群遗传研究中应用较少，仅在单一地区松材线虫上有过报道且未发现可用于种群分类的SNP位点。而不同地理来源松材线虫SNP差异的相关报道尚未发现，且本发明中使用的部分软件也属于自主开发。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种分析松材线虫种群遗传多样性的方法，通过Illumina高通量基因组测序，利用SNP分子标记分析松材线虫种群遗传多样性，从分子的角度分析出不同地理位置松材线虫的亲缘关系，为该病害防控策略的制订提供可靠的理论依据。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种分析松材线虫种群遗传多样性的方法，先收集来自于不同地理位置的松材线虫虫株，提取其DNA并进行高通量测序；利用生物信息学软件分析全基因组信息，得到各种SNPs数据及基因型类型，获知松材线虫体内SNPs位点分布情况，进行聚类分析，筛选获得特异性SNP位点。

所述的分析松材线虫种群遗传多样性的方法，步骤如下：

1)收集广东省和四川省松材线虫病疫木，利用贝尔曼漏斗法分离疫木中的线虫；收集线虫液，并扩大培养，将得到的线虫液置4℃冰箱中保存备用；

2)松材线虫DNA的提取

3)将检测合格的松材线虫DNA进行高通量基因组测序；测序使用平台为HiSeq4000，测序方法为非链特异性、150bp双末端测序，测序深度40x。松材线虫高通量测序