[发明专利]一种分析松材线虫种群遗传多样性的方法

权利要求书

1.一种分析松材线虫种群遗传多样性的方法，其特征在于，先收集来自于不同地理位置的松材线虫虫株，提取其DNA并进行高通量测序；利用生物信息学软件分析全基因组信息，得到各种SNPs数据及基因型类型，获知松材线虫体内SNPs位点分布情况，进行聚类分析，筛选获得特异性SNP位点。

2.根据权利要求1所述的分析松材线虫种群遗传多样性的方法，其特征在于，步骤如下：

1)收集广东省和四川省松材线虫病疫木，利用贝尔曼漏斗法分离疫木中的线虫；收集线虫液，并扩大培养，将得到的线虫液置4℃冰箱中保存备用；

2)松材线虫DNA的提取

3)将检测合格的松材线虫DNA进行高通量基因组测序；测序使用平台为HiSeq 4000，测序方法为非链特异性、150bp双末端测序，测序深度40x。松材线虫高通量测序

4)利用生物信息学软件分析高通量测序返回的原始数据，得到SNPs数据及基因型数据，获知松材线虫体内SNPs位点分布情况，进行聚类分析，筛选出广东特异性SNP位点。

3.根据权利要求2所述的分析松材线虫种群遗传多样性的方法，其特征在于，步骤1)中，收集线虫液于15mL离心管中，在显微镜下挑取线虫液中的松材线虫雌雄虫30～50条，接入长满灰葡萄孢的PDA平板中，25℃培养至灰葡萄孢全部被吃完；用贝尔曼漏斗法将培养好的线虫收集于15mL离心管中，3500rpm离心3min；去掉上清液，1:1体积加入0.1％硫酸链霉素，摇匀，静置5～10min，离心，去上清；用无菌水反复洗涤3次，将得到的线虫液置4℃冰箱中保存备用。

4.根据权利要求2所述的分析松材线虫种群遗传多样性的方法，其特征在于，步骤2)中，提取方法为：取保存的200μL线虫液于Eppendorf管中，加入200μL线虫裂解液，混匀；在65℃水浴中处理1h，每隔10min摇荡1次；冷却至室温后，用等体积的酚抽提，4℃条件下，12000rpm离心20min，取上清液；用等体积酚：氯仿：异戊醇抽提，离心；用等体积氯仿：异戊醇，离心；在上清液中加入1/10体积的3mmol/L的乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，在-80℃条件下冷冻20min；12000rpm离心20min，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，室温晾干，沉淀气干1h；加入100μL TE重新悬浮沉淀，取其中5μL用无菌水稀释200倍，用紫外光分光光度计测定DNA浓度，-20℃备用。

5.根据权利要求2所述的分析松材线虫种群遗传多样性的方法，其特征在于，步骤3)中，测序前，首先用Nanodrop2000测定1.2中提取的DNA浓度，再通过1％琼脂糖凝胶电泳来检测DNA质量。

6.根据权利要求2所述的分析松材线虫种群遗传多样性的方法，其特征在于，步骤4)中，四川省虫株单独聚为A类，广东省虫株分为B类和C类。