[发明专利]表达量高和活性强的纤连蛋白突变体的编码序列及其应用

说明书

本发明公开了一种纤连蛋白突变体及其制备方法与应用。本发明提供的纤连蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码序列如SEQ ID NO.3所示。该编码序列是选择纤连蛋白上促进细胞增殖、促进细胞粘附活性结构域，利用翻译暂停理论，在不改变重组纤连蛋白氨基酸序列的情况下，将重组纤连蛋白最后30个密码子中翻译速度较快的密码子替换成翻译速度较慢的密码子获得。该编码序列显著促进了纤连蛋白突变体在大肠杆菌中的可溶性表达。由此编码序列经构建重组载体、表达、纯化得到的纤连蛋白突变体，其促进细胞增殖活性粘附活性的功能有明显提升。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种纤连蛋白突变体及其制备方法与应用。

背景技术

纤连蛋白（Fibronectin，FN）是一种多功能的糖蛋白，在血浆中含量丰富，广泛分布于细胞外基质中。纤连蛋白调节多种细胞的粘附、扩散、迁移、增殖、分化，从而在胚胎发育、组织修复中发挥重要作用。纤连蛋白形成细胞运动及定位的基质，介导成纤维细胞、巨噬细胞等参与损伤修复。

纤连蛋白通过与细胞表明的受体结合发挥重要的生理功能，是胚胎发育中必不可少的物质，可以指导胚胎发育过程中细胞黏附和迁移；例如，与细胞表明整合素受体a5β1结合，动物实验结果表明，突变纤连蛋白上与a5β1结合的位点，会导致小鼠胚胎的死亡。纤连蛋白与其他糖蛋白、细胞外基质分子结合，有利于伤口止血及伤口修复；纤连蛋白可以交联胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖等，为细胞提供稳定的基质平台。

纤连蛋白有两个亚基（单体）组成，每个亚基分子量在220～250 KDa，两个亚基通过C-末端的二硫键相连。每个纤连蛋白单体主要有12个I型、2个II型、15～17个III型三种类型的重复单元组成。纤连蛋白中含有整合素、胶原蛋白、肝素、纤维蛋白的结合结构域。例如在FN III10中的整合素结合位点Arg-Gly-Asp（RGD）基序，III9中的Pro-His-Ser-Ser-Arg-Asn（PHSRN）基序等。通过基因的选择性剪接以及翻译后修饰，纤连蛋白有大约20种突变体。

纤连蛋白是细胞外基质的重要组成部分，通过与细胞表面受体及细胞外基质分子的相互作用，促进细胞粘附、迁移，促进创伤修复，因此，纤连蛋白在医学、美容、护肤领域有广泛的应用前景。虽然动物组织、血液中含有纤连蛋白，但是含量极为有限，因此，组织来源的纤连蛋白存在产量低，成本高，产品纯度低的缺点。重组DNA技术通过构建线路蛋白基因的表达载体，在原核或者真核生物中表达、制备高纯度的纤连蛋白。纤连蛋白单体约220～250KDa,分子量较大，研究表明，通过选择纤连蛋白上的部分结构域，重组DNA技术制备含有纤连蛋白部分结构域的突变体，具有纤连蛋白的生物学活性。但是，如何筛选纤连蛋白的活性结构域进行重构，获得高活性、高稳定性的纤连蛋白突变体是制约纤连蛋白应用的关键技术之一。此外，重组蛋白异源表达时，往往表达量低，或者以包涵体形式表达，这也是制约纤连蛋白应用的另一关键技术。

最新的研究表明：不同的DNA虽然可以翻译成同样的氨基酸，蛋白质生成的速度（翻译速度）并非恒定，在某些区段上会比较缓慢，这种现象称为翻译暂停（translationalpausing 或 translational attenuation）翻译暂停位点与蛋白质折叠高度相关，若翻译暂停位点不正确，该慢的地方快了，或者该快的地方慢了，都将导致蛋白质错误折叠聚集，无法得到有功能的可溶性蛋白。也就是说，蛋白质空间构象不仅由氨基酸的序列决定，也由核苷酸序列决定。通过这一理论可以合理重设计和优化蛋白质的核苷酸序列，使其在大肠杆菌中表达过程中以合适速度翻译、折叠，从而促进蛋白质的可溶性表达。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷与不足，本发明的首要目的在于提供一种纤连蛋白突变体。

本发明的另一目的在于提供通过上述纤连蛋白突变体的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述纤连蛋白突变体的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：