[发明专利]一种卵透明带结合试验中的精子计数方法

说明书

本发明提供一种优化的在卵透明带结合试验中对精子的计数方法。所述方法操作简便，所用试剂易获取，可显著降低试验成本，并解决其因操作复杂，对检测人员要求过高，使其在临床中推广受限的技术问题。

技术领域

本发明涉及一种优化的透明带结合实验方法，更为具体的，本发明涉及一种卵透明带结合试验中的精子计数方法。

背景技术

不孕症是指夫妻双方在12个月或更长时间内频率正常的无保护性交后未能达到临床妊娠。在发达国家,不育症发生率为5.0-8.0%,而在发展中国家则高达5.8-44.2%，其中由于男性因素导致的不孕占40-50%，约有2%的孕男性精液参数未达到标准。目前临床上对于男性不孕的实验室诊断主要根据《WHO人类精液检查与处理实验室手册（第5版）》，使用计算机辅助精子分析（Computer-aided sperm analysis, CASA）进行精液常规分析，将计算机处理技术和的图像处理技术结合在一起，通过对图像中的精子进行全面分析，可检测精液中精子的密度、活率、活力和精子运动特征等各项量化的指标，从而分析精子的一般状态及运动特征，并将其作为评价男性生育力的重要依据。但是精子从发生到最终形成受精卵需要经过精子获能、顶体反应、结合并穿过透明带、精卵结合等一系列复杂的过程，仅凭对精子形态学指标进行分析，并不能准确反应精子受精能力。因此，临床上需要对精子功能进行检测以充分评估男性生育力。随着辅助生殖技术的发展，特别是卵母细胞胞质内单精子注射技术（Intracytoplasmic sperm injection, ICSI）的出现和推广，使得精子功能缺陷的不孕男性生育率提高。但是该技术为侵入性操作，且花费较高，因此充分评估精子功能，把握新技术的应用指征，对不孕男性患者有重大意义。人卵透明带试验旨在检测精子与透明带结合的能力，作为检测精子功能的方法之一，为临床全面评估男性生育能力及制定下一步治疗方案提供参考。

人卵透明带试验目前主要有两种方法,一种是半卵透明带检测试验,另一种是精子-透明带结合试验。半卵透明带检测试验是将透明带显微切割成相等的两部分,分别与相同密度的待检测精子和对照精子进行试验，计数每部分卵子分别结合的卵子，评价待检精子与卵子透明带结合的能力。半透明带结合试验经显微切割后，呈现为两个大小均等的半圆形。将等密度处理好的精液加入后，可能会同时与半透明带的内外面相结合，因此在进行精子计数时，应按照一个方向逐步对焦，由内而外或由外而内计数，避免重复。由于两半透明带来自同一个卵，理论上与精子的结合能力应该一致，一半作为实验组一半作为对照组，起到了控制变量的作用。精子-透明带结合试验是用不同的荧光染料分别标记待检测精子和对照精子，即待检测精子用一种荧光染料染色，而对照精子用另一种荧光染料染色，计算结合在同一个卵透明带上的待检测精子和对照精子的数量和比值。

然而，利用这两种方法对精子进行计数时均存在较为明显的缺点：半卵透明带检测试验是将透明带显微切割成相等的两部分进行对照试验，其中切割卵子且保持两部分相等对试验人员的技术要求过高，而精子-透明带结合试验是用不同的荧光染料分别标记精子，计算卵子上结合的待测精子与对照精子的比例进而评判待测精子的结合能力，但是该方法荧光染色剂较昂贵，且操作繁琐，需要在荧光显微镜下观察计数。因此亟需对现有技术进行改进，使精子的计数更为简单高效。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种优化的在卵透明带结合试验中对精子的计数方法。所述方法操作简便，所用试剂易获取，可显著降低试验成本，并解决其因操作复杂，对检测人员要求过高，使其在临床中推广受限的技术问题。

具体的，本发明提供的卵透明带结合试验中的精子计数方法包括如下步骤：

(1) 精子准备；

(2) 卵子准备；

(3) 配子共培养：

a. 用胚胎转移管（商品化或用巴斯德吸管拉制）吸取所需数量的卵母细胞，将其转移至已调好精子受精密度的受精培养液中；

b.在CO₂培养箱内孵育3小时；

c.从受精培养液中回收卵母细胞；