[发明专利]一种卵透明带结合试验中的精子计数方法

权利要求书

1.一种卵透明带结合试验中的精子计数方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)精子准备；

(2) 卵子准备；

(3) 配子共培养：

a.用胚胎转移管吸取所需数量的卵母细胞，将其转移至已调好精子受精密度的受精培养液中；

b.在CO₂培养箱内孵育3小时；

c.从受精培养液中回收卵母细胞；

d.用胚胎转移管在G-MOPS PLUS培养液中冲洗掉疏松附着在卵母细胞上的精子；

(4) 卵母细胞的分析

a.准备载玻片，将3-5μL伊红染料滴于载玻片上，制备伊红染料微滴；

b.将卵母细胞放入伊红染料微滴；

c.覆盖盖玻片；

d.在放大倍数为×10-80的体视显微镜下观察伊红染料盖片，找到压扁的卵母细胞，在载玻片底面划“圈”，圈出卵的大概位置；

e.在放大倍数为×40的倒置显微镜下观察压片，寻找标记的圆圈并找到卵母细胞，移动载物台，将卵母细胞移至视野中央，转换至放大倍数为×200的高倍镜下观察；

f.计数透明带上的精子。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）包括：a.充分混匀精液标本；b.用密度梯度离心法或上游法分离精子；c.用巴斯德吸管轻柔地吹吸并混匀精子，测定精子的密度、活力；d.用受精培养液稀释精子至受精密度。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述受精培养液为vitrolife的洗精受精液。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述受精密度为约0.2×10⁶个精子/ml。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的卵母细胞在使用前储存在37℃，6% CO2培养箱中备用。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中配子在37℃、含6v/v% CO₂的环境中孵育。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中所述胚胎转移管直径≥200μm。