[发明专利]哺乳动物冻存睾丸组织异种异位移植模型的构建方法

说明书

本发明公开的属于睾丸移植小鼠模型建立技术领域，具体为哺乳动物冻存睾丸组织异种异位移植模型的构建方法，其包括以下步骤：S1：研究所取用荷斯坦公牛的小牛睾丸，添加冷冻保护剂后于液氮中冻存；S2:将戊巴比妥钠麻醉剂和戊巴比妥钠粉末溶于生理盐水中，完全溶解后用滤器过滤，并在低温条件下保存。该哺乳动物冻存睾丸组织异种异位移植模型的构建方法，在未成熟哺乳动物优良种质资源的保护方面具有切实的应用意义，能在有效低温保存睾丸组织的前提下，以5周龄BALB/cNude免疫缺陷小鼠作为移植受体，结合基质胶的促血管生成作用，使得生精周期差异较大的鼠、牛种属间所移植的睾丸组织得以存活并基本保持正常的发育状态。

技术领域

本发明涉及睾丸移植小鼠模型建立技术领域，具体为哺乳动物冻存睾丸组织异种异位移植模型的构建方法。

背景技术

睾丸是具有生精和内分泌功能的重要性腺器官，其内的精原干细胞是雄性生殖力保存和恢复的保障。睾丸组织冷冻保存既可为未成年雄性生殖能力的保存提供新选择，也是保障基因多样性的手段，在生命科学、农业科学和再生医学领域有良好的应用前景。

精子发生的启动与丘脑-垂体-睾丸性腺轴密切相关。在青春期前，由于缺乏内分泌激素的刺激，致使未成熟睾丸中精子发生处于静止状态。因此，将未成熟的睾丸组织移植到丘脑促性腺激素、促性腺激素释放激素、促黄体生成素、卵泡刺激素等分泌水平处于成年状态的受体动物中时，可促进精子发生进程。

冷冻-复苏哺乳动物未成熟睾丸组织的异种异位移植作为体内模型，通过将供体来源的睾丸组织冷冻-复苏处理后移植埋入去势的免疫缺陷小鼠背部皮下，使其存活并继续生长发育。该技术联合睾丸组织冷冻保存不仅是揭示睾丸生理学和雄性生殖细胞发育的有用工具，为转基因动物、突变或克隆动物的研究提供有了利条件，同时对幼龄雄性生殖细胞系的保存提供了新思路，为优良种畜、珍稀及濒危物种种质资源保护提供有价值的方案。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施方式的一些方面以及简要介绍一些较佳实施方式。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：

哺乳动物冻存睾丸组织异种异位移植模型的构建方法，其包括以下步骤：

S1：研究所取用荷斯坦公牛的小牛睾丸，添加冷冻保护剂后于液氮中冻存；

S2:将戊巴比妥钠麻醉剂和戊巴比妥钠粉末溶于生理盐水中，完全溶解后用滤器过滤，并在低温条件下保存；

S3：选取免疫缺陷鼠全身麻醉后仰卧保定，于阴囊处做一微型切口，牵拉睾丸至切口外，钳夹精索将睾丸摘除，镊子在酒精灯火焰上灼烧后将断端烧烙止血，精索和脂肪垫还纳腹腔后缝合切口；

S4：冻存的犊牛睾丸组织于适当温度水浴锅中复苏，并剪切成多个较小组织小块，置于冰上备用；

S5：小鼠俯卧保定后，在脊柱两侧分别做多个微型切口，将冷冻复苏后的犊牛睾丸组织小块植入切口内，并与切口一并缝合固定，每个切口注射一定量基质胶，伤口涂布碘伏消毒，放回笼内密切观察小鼠状态。

作为本发明所述的哺乳动物冻存睾丸组织异种异位移植模型的构建方法的优选方案，其中：根据步骤S1：研究所用的小牛睾丸取自1日龄、30日龄的荷斯坦公牛，冷冻保护剂的组成成分包括：75％基础培养基KnockoutDMEM，10％血清替代物KSR，10％二甲基亚砜DMSO，5％青-链霉素，其中青霉素浓度为10000Units/mL，链霉素浓度为10000μg/mL。

作为本发明所述的哺乳动物冻存睾丸组织异种异位移植模型的构建方法的优选方案，其中：根据步骤S2：采用2％戊巴比妥钠麻醉剂：2g戊巴比妥钠粉末，同时溶于100mL生理盐水中，通过0.22μm的滤器进行过滤，保存温度维持在4℃。