[发明专利]一种伪狂犬病病毒的检测方法

说明书

本发明提供了一种伪狂犬病病毒的检测方法，运用纳米PCR进行PRV检测，采用序列表中SEQ ID No.1‑2所示核苷酸序列、上下游引物浓度为0.1μmol/L、退火温度为50℃和SEQ ID No.3‑4所示核苷酸序列、上下游引物浓度为1μmol/L、退火温度为50℃进行检测时具有灵敏度高、特异性强、扩增条件宽松、可特异性检测野毒株等优势。

技术领域

本申请涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种伪狂犬病病毒的检测方法。

背景技术

伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)属于疱疹病毒科(Herpesviridae)α-疱疹病毒亚科(Alphaerpesvirinae)水痘病毒属(Varicellovirus)，可以感染猪、绵羊、狗、牛、猫、兔和鼠等多种动物，其主要引起发热、奇痒(猪除外)和脑脊髓炎等症状。

纳米PCR(nano-PCR)技术是将纳米材料(如金纳米粒子、银纳米粒子、碳纳米粒子和氧化锌纳米粒子等)添加到PCR反应体系中，以便调控PCR，达到相较于常规PCR无法达到特殊效果的作用，为优化常规PCR提供了新的思路和技术。2005年，Li H等人(NanoparticlePCR:Nanogold-assisted PCR with enhanced specificity[J]Angewandte chemie-international edition.2005,44:2-5)发现纳米金粒子在PCR技术中能够提高DNA聚合酶的活性和稳定性，显著提高PCR的特异性扩增作用。Yan L等(Mechanism of goldnanoparticle induced simultaneously increased PCR efficiency and specificity[J].Chinese Science Bulletin,2013,58(036):4593-4601)研究金纳米粒子的添加对PCR的扩增效率和特异性的影响，结果发现金纳米粒子可通过提高PCR溶液的热导率来提高PCR的扩增效率和特异性。目前国内外学者运用该技术建立了多种病毒的鉴定检测。

PRV基因组约为150kb的双链线性DNA，平均GC含量为73％左右，PRV基因组含有多达70个基因，编码大约100种蛋白质。已有研究者运用PCR方法鉴别PRV的野毒株。例如张悦勇等(猪伪狂犬病毒纳米PCR检测方法的建立[J].中国动物检疫,2017,034(003):102-105)针对PRV gB基因设计了一对引物，建立了检测PRV的纳米PCR方法，但是由于该方法既可检测PRV野毒株，也可以检测疫苗株，因此在临床上使用时无法鉴定出PRV的感染是否来源于野毒株。马兴杰(鉴别猪伪狂犬病毒gE/gB/gG的纳米PCR及荧光定量PCR方法的建立及评价[D].中国农业科学院,2014)等针对PRV的gE/gB/gG基因建立了三重纳米PCR，但是该方法耗时需要90分钟才能完成PCR反应，具有耗时长、所需退火温度严格等缺点。

基于以上原因，亟待提供一种能够快速高效检测PRV病毒的检测方法。

发明内容

本发明提供了一种伪狂犬病病毒的检测方法，该检测方法包括如下步骤：

(1)DNA模板扩增；

(2)纳米PCR扩增；

(3)PCR产物检测。

其中，纳米PCR扩增中的引物对序列选自序列表中SEQ ID No.1-2、SEQ ID No.3-4或SEQ ID No.5-6。

纳米PCR反应体系为每20ul反应体系中，1μL DNA模板，2×Nano-QPCR buffer 10μL，工作浓度为20μmol/L的上下游引物混合液0.1-1μL(终浓度为0.1-1μmol/L)，5U/uL taqenzyme Mix0.32μL，加ddH₂O补足20μL。