[发明专利]一种再生有色毛发注射剂及其制备方法

权利要求书

1.一种再生有色毛发注射剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）获取头皮组织，消化后分离出原代表皮干细胞、原代黑色素细胞和原代真皮成纤维细胞，具体步骤如下：

S1：获取头皮组织，消毒后置于解离酶和胰酶的混合溶液中，37℃消化10-120min，使用含10% FBS的DMEM培养基中和酶反应，形成中和液A；解离酶和胰酶的混合溶液中解离酶终浓度为0.5~5.0 mg/mL，胰酶终浓度为0.05%~0.5%；所述头皮组织为含有毛囊及毛乳头部分的枕部头皮组织；

S2：吹打中和液A后，将中和液A过70μm滤网，获得滤液A和滤渣A；

S3：滤液A使用600rpm离心4-5min保留沉淀A；

S4：滤渣A中加终浓度为0.25~5.0 mg/mL的胶原酶Ⅰ溶液在37℃中消化10~120min，使用含10% FBS的DMEM培养基，反复吹打2~60次，中和酶反应，形成中和液B；

S5：中和液B过100μm滤网过滤，保留滤液B，将滤液B使用600-1000rpm离心4-5min，获得沉淀B；

S6 步骤S3获得的沉淀A和步骤S5获得的沉淀B分别各自使用DMEM培养基重悬后计数，从沉淀A中获得的细胞分为2部分，一部分使用人皮肤表皮细胞培养基培养，另一部分使用黑色素细胞培养基培养；从沉淀B中获得的细胞使用多功能无血清细胞培养基培养；即可分离出表皮干细胞、黑色素细胞和真皮成纤维细胞；

2）将步骤1）中获得的原代表皮干细胞传代培养，收集P3-P5代的表皮干细胞接入细胞培养瓶中；

3）黑色素细胞和真皮成纤维细胞按照数量比1：（5-20）的比例混合，加入多功能无血清细胞培养基进行重悬，重悬后接种于培养板中，培养2-3天，形成黑色素细胞和真皮成纤维细胞的3D细胞团，收集3D细胞团悬液离心，保留上清液和离心后的3D细胞团；

4）步骤2）收集的表皮干细胞和步骤3）中离心后的3D细胞团按照数量比（2:1）-（1:5）的比例混合，使用步骤3）中获得的上清液重悬混合后的细胞；

5）将步骤4）获得的混合后的细胞用不含双抗的DMEM清洗，离心后弃上清，沉淀用步骤3）中收集的上清液重悬，即可获得再生有色毛发注射液。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中所述的细胞培养瓶中加入8~12mL皮肤表皮细胞培养基，P3-P5代的表皮干细胞按照120-150万/T75瓶接种到细胞培养瓶中。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5）中所述的离心的条件为600-1000rpm离心5min。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述的消毒的方法为：将头皮组织使用DPBS漂洗2次，置于75%的酒精中浸泡5min，然后置于含青链霉素双抗的PBS浸泡5min，浸泡2次。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述胶原酶Ⅰ溶液和含10% FBS的DMEM培养基使用的体积比为1:1。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S6中所述的黑色素细胞培养基为不含TPA成分的培养基。

7.如权利要求1-6中任一项制备方法制备的再生有色毛发注射剂在促进有色毛发生长中的应用。