[发明专利]解淀粉芽孢杆菌脲酶在食品级枯草芽孢杆菌中的重组表达

说明书

本发明公开了解淀粉芽孢杆菌脲酶在食品级枯草芽孢杆菌中的重组表达，属于酶工程技术领域。本发明通过枯草密码子优化、核糖体结合位点优化重构基因簇，使脲酶活力从6.85U/mL提升至9.01U/mL；通过调整基因ureC至ureA、ureB前，强化了UreC的表达，脲酶活力进一步提升至10.15U/mL，相对于原始脲酶活力提高了48％。重组脲酶最适反应温度为37℃，最适反应pH范围为6.5‑7.0。经过摇瓶发酵条件优化，确定TB培养基、5％接种体积分数、28℃诱导温度、4mmol/L Ni²⁺添加量为最佳发酵条件，酶活力达到了12.5U/mL，相对于原始脲酶活力提高了82％。本发明技术在生物酶法降低黄酒尿素含量具有应用潜力。

技术领域

本发明涉及解淀粉芽孢杆菌脲酶在食品级枯草芽孢杆菌中的重组表达，属于酶工程技术领域。

背景技术

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate或Urethane，简称EC)，是一种存在于发酵食品和酒精饮料(奶酪、酱油；黄酒、清酒、威士忌)中的氨类危害物。2007年，国际癌症研究机构IARC(International Agency for Research on Cancer)正式将EC上升为2A类致癌物，与丙烯酰胺同等危险，引起人们对其食品安全的广泛关注。

尿素是黄酒中与乙醇反应生成EC的最主要前体物质。因而，去除黄酒中EC的主要策略是直接降低EC的含量和间接降低前体物质尿素的含量。脲酶(Urease，EC 3.5.1.5)因其不需更换酵母或生产工艺、直接高效的特性而在解决黄酒中EC的食品安全问题中占据优势。

目前，已报道的脲酶通常来自于发酵乳杆菌、运动节杆菌、肠杆菌属、罗伊氏乳杆菌、副地衣芽孢杆菌、葡萄球菌等，然而，这些微生物来源的脲酶基因簇的基因组成较为复杂，编码相应脲酶的活化过程需要所有辅助亚基UreE、UreF、UreG、UreD/UreH的参与，缺一不可，且相关辅助亚基的功能并不清晰。而来源于解淀粉芽孢杆菌的基因簇通常包含UreA、UreB、UreC三个结构亚基，基因异源表达及调控的可行性较高，然而，已报道来源于解淀粉芽孢杆菌JP-21的脲酶基因簇仅在大肠杆菌系统中重组表达，难以用于传统发酵食品加工体系。

为达到食品安全应用，脲酶基因的异源表达备受关注。枯草芽孢杆菌是当前研究得最好的食品安全级微生物(GRAS)，已被广泛用于生产各种工业酶。但，尚无利用枯草系统表达重组脲酶。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是现有利用大肠杆菌表达的脲酶不适用于传统发酵食品加工体系。

[技术方案]

本发明在枯草芽孢杆菌中实现了基因挖掘所得的解淀粉芽孢杆菌IT-45来源的脲酶基因簇(ureABC)的表达，并通过密码子优化、核糖体结合位点优化以及调整基因ureC的位置，进一步提升脲酶活力，本发明制备得到的脲酶在酶法降解黄酒中的尿素应用上具有潜力。所述解淀粉芽孢杆菌IT-45来源的脲酶基因簇(ureABC)的序列如SEQ ID NO.1所示，该脲酶有三个结构亚基：UreA、UreB、UreC，三个亚基的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

本发明提供经过重构的编码脲酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ IDNO.6所示。

本发明提供携带编码脲酶基因的载体。

本发明提供表达所述经过重构的编码脲酶的基因的重组枯草芽孢杆菌，宿主可选自：B.subtilis WB600、B.subtilis WB700、B.subtilis WB800或B.subtilis WB168，表达载体可选自：pP43NMK、pHT43、pMA5或pTTB。

本发明提供一种构建表达经过重构的编码脲酶的基因的重组枯草芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：