[发明专利]一种预防冠状病毒感染的益生酸奶及制备方法

说明书

一种预防冠状病毒感染的益生酸奶及制备方法，将ACE2、S1‑RBD和/或IL‑10基因连接胞壁锚定基因或分泌型基因，然后克隆至以半乳糖苷酶为筛选标志的质粒、胞外锚定质粒或分泌型质粒，构建重组质粒，转化半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌，获得能在胞内、胞壁或胞外定位表达ACE2、RBD和/或IL‑10融合蛋白的以半乳糖苷酶筛选的重组益生菌，以海藻酸钠包被成抵抗胃液的微胶囊，配制成发酵酸奶，口服后重组菌定植于肠道持续表达外源基因，其中表达的ACE2蛋白能封闭病毒RBD并有利于氨基酸吸收和心血管，IL‑10起抗炎作用；产生的抗‑ACE2能封闭ACE2受体，抗‑RBD能封闭病毒RBD，阻断病毒通过RBD与ACE2受体结合感染；重组菌有维持肠道微生态、提高免疫力、产生多种维生素等益生作用。

技术领域

本发明涉及一种预防冠状病毒感染的益生酸奶及制备方法，属于生物医学领域的传染病防治技术。

背景技术

感染人类的冠状病毒主要包括SARS-COV、MERS-COV和SARS-CoV-2，都通过宿主细胞的血管紧张素转换酶2(ACE2)引起感染。

如SARS-CoV-2(新型冠状病毒)，其主要结构包括单股正链核酸(ssRNA)、刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核壳蛋白(N)，通过其S蛋白的受体结合域S1-RBD识别、结合宿主细胞表面受体ACE2，引起感染。

目前新冠病毒疫苗主要以S蛋白或其RBD为靶点设计开发，包括基因重组疫苗、载体疫苗(腺病毒载体或减毒流感病毒载体)和核酸疫苗(mRNA疫苗或DNA疫苗)。其作用的共同机制是使宿主产生抗新冠病毒受体结合域(S1-RBD)抗体，当这种抗体与S1-RBD结合后，新冠病毒就不能通过S1-RBD识别并结合宿主细胞表面受体(ACE2)，所以就失去了感染性。

综上，新冠病毒的S1-RBD能与宿主细胞表面受体ACE2结合，并通过S1-RBD与ACE2结合感染宿主细胞；现有技术的新冠病毒疫苗通过刺激宿主产生抗新冠病毒S1-RBD的抗体而起免疫作用，即通过疫苗接种产生的特异性抗体与S1-RBD结合来阻断S1-RBD与宿主细胞表面受体ACE2结合，从而达到预防的目的。但未见通过疫苗接种产生的ACE2与S1-RBD结合来阻断S1-RBD与宿主细胞表面受体ACE2结合从而达到免疫预防的ACE2疫苗报道。

现有疫苗如果接种后某些体质产生低滴度抗体、非中和抗体或亚中和抗体，就有产生抗体依赖性感染增强(antibody dependent enhancement，ADE)的风险，ADE指病毒感染后产生的特异性抗体对病毒感染不但没有起到抑制作用反而起促进作用。文献报道ADE是SARS COV和MERS COV入侵免疫细胞的重要方式，发现高浓度SARS COV抗血清可中和SARSCOV感染，高度稀释后的抗血清则触发ADE，因SARS-COV-2与SARS COV和MERS COV均属于β冠状病毒，推测SARS-COV-2也可能存在ADE，而不产生上述抗体的ACE2疫苗则没有ADE风险。

现有疫苗的载体，如目前应用最广泛的人腺病毒5型(Ad5)载体，虽然其细胞毒性和免疫源性减弱、外源基因表达时效提高、可感染的细胞多而应用广，但易引起非特异性感染而不适用于靶向治疗。Ad5不与宿主细胞DNA整合，所以易被网状内皮细胞吞噬，使目的基因表达不稳定。同时由于Ad5无法复制，会使体内重组病毒越来越少，所以不适用于慢性疾病的长期治疗。Ad5本质为病毒，仍具有免疫源性和细胞毒性，宿主对病毒载体的免疫应答会干扰对目的抗原的免疫应答，大多数正常人已受过腺病毒感染，对病毒载体的预存免疫也会干扰疫苗的免疫效果，而以益生菌为载体的ACE2疫苗则没有腺病毒载体的副作用，且ACE2是一种I型跨膜糖蛋白，N端在胞膜外，通过单次跨膜锚定在细胞表面，C端在细胞膜内，对氨基酸的吸收和心血管等器官的保护均具有重要的作用。