[发明专利]基于吡唑啉酮的糖蛋白结合型膜染料、其制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种基于吡唑啉酮的糖蛋白结合型膜染料，该膜染料通式结构如式(Ⅰ)所示，式(Ⅰ)中，R₁为具有O端或者N端的荧光发色团染料结构；R₂选自‑O‑、‑O‑O‑、‑S‑、‑NH‑、‑NHNH‑或‑ONH‑中的至少一种；R₃选自或中的至少一种。其用于长滞留细胞膜追踪成像，和/或用于在低浓度下细胞膜的快速精准的成像，和/或用于观察细胞分裂、迁移过程，和/或用于膜标记以区分共培养细胞，和/或用于区分不同细胞的荧光信号、和/或用于细胞的标记和分群，和/或用于传代细胞的追踪。

技术领域

本发明涉及光化学与生物成像领域，尤其涉及到细胞膜染色技术与应用，具体涉及到基于吡唑啉酮а-H位点可实现低浓度下快速结合型并具有超长滞留时间的一系列细胞膜染料、其制备方法与应用。

背景技术

细胞膜(又称细胞质膜)，是细胞与周围生理环境的生理屏障，主要由构成骨架的磷脂双分子层和嵌于细胞膜内部或表面的蛋白质和细胞膜表面的糖蛋白这三种主要成分构成，其在保障细胞内环境稳定的同时能够与外界环境进行物质、能量与信息的交换。细胞膜已经被证明能够参与多种生物学过程，如细胞迁移、扩散、吞噬以及内吞。此外，标定细胞膜在体外研究中同样具有意义，如观察细胞膜状态，标记细胞边界，以及区分细胞内亚细胞器。因此，实现灵敏的长期的细胞膜的细胞活体成像在体外细胞研究中具有重要的，能够在不影响细胞活性的基础上能够长期观测细胞膜状态和活性。其中，荧光成像技术由于其高灵敏性、低成本、操作便利、生物安全性高被广泛用于细胞及生物研究中的成像技术。

目前膜定位荧光染料主要基于两种机理：1最主要也是目前商业化膜染料的细胞膜定位机理，基于一端亲油一端亲水的长链烷烃染料结构，通过静电吸附作用可嵌入到磷脂双分子层结构；2基于细胞膜上特意表达的标靶蛋白设计的靶向型膜染料。目前市面上用于体外细胞膜标记的荧光染料主要为DiO，DiI等染料以及其他嵌入磷脂双分子层结构，这类染料的主要问题在于膜上滞留时间短、所需浓度高(造成该两亲性结构易在水中聚集)。在使用时该类染料过高的杂色和进入细胞内的杂色会严重干扰对膜结构的持续观察，其只能保证培养并孵育后的短期时间(不超过1h)内较为清晰的成像，显然不能满足更多的需求。而对于基于靶标的膜染料之所以使用受限，主要归因于其高成本，该类染料实现的膜定位往往需要与膜上蛋白特异识别结合，且该类染料需要靶标大分子作为载体，因此合成成本较高，同时特异性蛋白在不同细胞间表达差异性大，因此该类染料在体外应用中受限较高。能否突破其固有的限制，开发低浓度下可以使用且能实现在细胞膜上长期滞留的广泛适用性的膜染料是亟需解决的技术问题。

发明内容

针对现有技术中的不足之处，本发明突破目前存在的两种膜染料机理，能够基于保留吡唑啉酮a-H活性位点的系列染料可结合于细胞膜表面糖结构实现普适性的细胞膜长期着色(现有技术中仅能达到1h以内有效，提高到超过2天依旧有效，着色时长相当于提高了近50倍)，该类染料工作浓度低(现有技术中商业膜染料的工作浓度至少需要1000nM，该发明提高到最低10nM依旧可以清晰的识别，相当于检测限降低100倍)且背景杂色低(0.5小时时，商染膜染料DiO在细胞内杂色为该类染料的三倍以上，而2小时时其细胞内杂色为该类染料20倍以上)。该发明从根本上解决了膜染料易进入细胞内，膜上滞留时间短以及因使用浓度高和自身聚集带来的背景杂色问题。同时，该结合型长期滞留膜染料在不影响体外细胞活性的同时，可用于共培养细胞的细胞标记，能够清晰地对不同株细胞的区分，可以避免如Hoechst染料用于区分共培养细胞时的严重串色问题。

本申请的技术方案如下：

本申请的第一方面在于保护一种基于吡唑啉酮的糖蛋白结合型膜染料，该染料能快速结合细胞膜表面糖蛋白，能用于长滞留细胞膜追踪成像以及作为膜标记区分共培养细胞的系列染料结构，通式结构如式(Ⅰ)所示：

式(Ⅰ)中

R₁为具有O端或者N端的荧光发色团染料结构。