[发明专利]评估肝谱系细胞成熟度的标志物、双组学试剂盒及构建方法

说明书

本发明提供了一种评估肝谱系细胞成熟度的标志物、双组学试剂盒及构建方法。本发明首次以新视角阐述了细胞发育中具有时序特征并且存在调控关系的microRNA集和基因集，建立了一种与调节肝细胞分化成熟相关的“转录因子‑microRNA‑靶基因”调控网络，并获得了肝谱系特异性的基因标签和microRNA标签，这些标签或它们的组合可作为肝谱系细胞潜在的新标志物。本发明也提供了肝谱系细胞的双组学试剂盒，为大规模扩增稳定的肝谱系细胞、监测肝谱系细胞的体外培养状态提供了新方案。

技术领域

本发明涉及生物医药领域；更具体地，本发明涉及评估肝谱系细胞成熟度的标志物、双组学试剂盒及构建方法。

背景技术

干细胞作为具有自我更新和多向分化潜能的细胞类型，为终末期疾病导致的器官功能丧失的治疗提供了有效的治疗新策略。目前，国际上已经有十余种干细胞治疗产品获批上市，而中国目前尚无产品获批。随着中国干细胞治疗产品管理规范逐渐完善，目前中国已有51项干细胞临床研究获得国家卫健委备案，另外有3款干细胞药品被药监局受理，获IND批准进入临床试验。肝脏作为人体代谢最重要的器官，以肝脏功能性缺失为特点的终末期肝病是危害人类健康的重大危害。中国是肝病大国，目前中国已经有8个与肝脏疾病相关的干细胞临床研究项目通过了备案。

然而，无论已经上市或者正在进行临床试验和临床研究阶段的干细胞产品，目前干细胞产品的生产工艺大多基于传统的二维培养体系。二维培养体系下，干细胞增殖能力有限、细胞干细胞容易丧失，且该体系人工成本高、生产损耗大、细胞批次质量不稳定，不适于干细胞产品产业化制备和生产。比较二维培养体系，三维培养模拟细胞在体内的自然状态，不但可以有效的维持干细胞和扩增过程中的干性，同时克服二维培养条件的耗材和制备空间损耗的问题，因此在干细胞产品规模化扩增中具有极大的优势。

目前，利用模拟细胞体内微环境的方式，基于微载体的干细胞三维培养扩增已经取得了非常好的进展。在微载体的基础上结合生物反应器，目前已经可以实现对包括脐带间充质干细胞在内的干细胞的规模化扩增，实现短期内获得百万级细胞的生产工艺。然而，从“小试”规模化的过渡尚有诸多问题有待明确，对干细胞在规模化扩增中的干性的维持的稳定性的监测，对于干细胞产品的质量(安全性和有效性)的保障是该过程中的重中之重。

目前常用可用于干细胞三维规模化扩增稳定性检测的指标，大多都是用于鉴定二维培养条件下干细胞特性的指标。比如脐带间充质干细胞，二维培养条件下维持的脐带间充质干细胞需满足干细胞表面标志、基因表达和成脂、成骨、成软骨分化的能力。这些指标同样作为金标准，广泛的应用于脐带间充质干细胞的三维规模化扩增细胞质量鉴定。

与脐带间充质干细胞不同，成熟的肝细胞在体外增殖能力有限。因此为了获得充足移植数量的肝细胞，目前本发明人通过获得可在体外增殖的肝前体细胞或者肝干细胞，并建立肝前体细胞或者肝干细胞的规模化扩增体系。获得充足数量可移植的细胞后，在移植前对肝前体细胞或者肝干细胞实现向肝细胞的诱导分化，从而获得充足的功能性的肝细胞进行移植治疗终末期肝病。

基于本治疗策略中涉及对肝前体细胞或者肝干细胞的扩增，以及肝前体细胞或者肝干细胞向肝细胞的功能性分化成熟两个阶段。如何实现在第一个阶段过程中对肝前体细胞或者肝干细胞规模化扩增中稳定性的检测，以及如何实现在第二个阶段中对肝细胞功能性成熟程度的评价，是实现规模化扩增的肝前体细胞或者肝干细胞治疗终末期肝病的关键。

目前，对于第一个阶段肝前体细胞和肝干细胞的干性的评价需基于干细胞基因表达和成熟标志低表达的方式进行评价，尚缺乏高敏感的评价标志。而对第二阶段成熟的肝细胞的稳定性检测和质量控制，需以更为复杂的功能性鉴定指标进行综合评价，其中包括细胞形态、肝细胞特异性基因表达水平检测、吲哚箐绿摄取/排秘、脂肪合成、白蛋白分泌、尿素合成、药物代谢等。由于其评价标准复杂，难以在规模化扩增过程中推广。因此，亟需一种可对不同阶段肝干细胞、肝前体细胞和肝细胞进行干性或者成熟程度评价的标志。