[发明专利]一种脑转移相关基因的CRISPR/Cas9文库高通量筛选方法

说明书

本发明公开了一种脑转移相关候选基因的CRISPR/Cas9文库高通量筛选方法，该方法包括构建脑转移相关基因的sgRNA文库，将sgRNA文库进行慢病毒包装，感染稳定表达CAS9蛋白的宿主细胞，并筛选以获得稳定表达sgRNA文库的细胞，然后，将慢病毒感染后的细胞接种于免疫缺陷的小鼠颅内及脂肪垫，最后，将颅内成瘤及皮下成瘤的肿瘤组织取出，提取基因组DNA后，对sgRNA的靶向区进行二代测序建库，通过筛选前后sgRNA的丰度变化，进而找出脑转移相关候选基因。该方法建立了脑转移相关基因高通量筛选技术，能够准确、高效地挖掘调控脑转移的关键基因，为脑转移预防和治疗提供新靶点、新途径。

技术领域

本发明属于癌症诊断技术领域，涉及一种脑转移相关基因的CRISPR/Cas9文库高通量筛选方法。

背景技术

CRISPR/Cas9系统由Cas9蛋白和sgRNA(single guide RNA)这两个组分组成。sgRNA可以识别带有PAM(protospacer adjacent motif)序列的互补序列，Cas9蛋白可以对靶DNA序列进行切割，因此Cas9/sgRNA系统可以通过sgRNA引导Cas9蛋白识别并剪切带有sgRNA靶点的特异性双链DNA，导致基因序列的插入或缺失，最终实现基因的定向编辑。CRISPR/Cas9文库是针对每个基因设计3-10条的sgRNA，利用芯片一次性合成针对数百甚至数万基因的sgRNA库，经过慢病毒包装后以低感染复数感染稳定表达Cas9蛋白的宿主细胞，在适当的筛选条件下测试筛选前后sgRNA的丰度变化，进而找出关键基因。CRISPR/Cas9文库筛选技术可以针对多个基因实现高通量的筛选，高效、快捷地筛选出研究者所需的关键基因。

目前，CRISPR/Cas9文库筛选技术多应用于：(1)体外加药筛选。将sgRNA文库包装成慢病毒后感染稳定表达Cas9的宿主细胞，而后将细胞培养于含有不同药物或不同药物浓度的培养基内，加药筛选培养一定时间后，测试筛选前后sgRNA的丰度变化。体外加药筛选可以筛选耐药/增敏基因，验证药物与基因所在信号通路之间的相互影响；(2)小鼠皮下瘤模型筛选肿瘤发生发展的相关基因。将sgRNA文库包装成慢病毒后感染稳定表达Cas9的宿主细胞，而后将细胞接种于免疫缺陷小鼠的皮下，待接种的细胞形成皮下瘤后，将皮下瘤取下并提取DNA，测试接种前后sgRNA的丰度变化。

肺癌、乳腺癌、黑色素瘤发生脑转移(Brain Metastasis,BM)的患者，由于缺少有效的治疗手段，预后极差。面对肿瘤的脑转移，目前手术、立体定向放疗、全脑放疗等局部治疗为脑转移的一线治疗方法，但由于其对影像学上不可见的潜在病灶的控制率差，局部治疗后颅内进展的发生率高。而全身系统治疗，如卡培他滨、替莫唑胺等，在脑转移中的治疗地位并不明确。临床医师面对颅内进展往往“束手无策”，颅内进展所致的死亡率高达37％。这提示脑转移问题——阐明可能机制、找到潜在干预措施是目前乳腺癌研究的重中之重。

肿瘤细胞的转移需经历从原发灶到转移灶的侵袭-转移级联过程。首先肿瘤细胞突破基膜侵入周围基质，而后进入脉管系统到达转移部位，并最终增殖形成临床可检测到的转移克隆灶。其中克隆灶形成是一个极端低效的过程，绝大部份细胞不能很好地适应转移灶的组织微环境。在其脑转移发生过程中细胞是如何适应颅内微环境的，此机制至今未明，研究也极少。显而易见，脑转移灶与乳腺原发灶的代谢微环境截然不同，转移瘤细胞要在新的微环境存活，首先需要代偿机制以适应新的微环境。

但目前并未有研究者提出如何将CRISPR/Cas9文库筛选技术应用于肿瘤的脑转移的研究中。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种通过CRISPR/Cas9文库筛选技术获得脑转移相关候选基因的方法。该方法建立了脑转移相关基因高通量筛选技术，拓宽了CRISPR/Cas9文库的使用范围，能够准确、高效地挖掘调控脑转移的关键基因，为脑转移预防和治疗提供新靶点、新途径。

本发明提供了一种脑转移相关候选基因的CRISPR/Cas9文库高通量筛选方法，包括以下步骤，