[发明专利]一种脑转移相关基因的CRISPR/Cas9文库高通量筛选方法

权利要求书

1.一种脑转移相关候选基因的CRISPR/Cas9文库高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤，

步骤S1、构建脑转移相关基因的sgRNA文库：

步骤S2、将sgRNA文库进行慢病毒包装，感染稳定表达CAS9蛋白的宿主细胞，并筛选以获得稳定表达sgRNA文库的细胞；

步骤S3、将慢病毒感染后的细胞接种于免疫缺陷的小鼠颅内及脂肪垫；

步骤S4、将颅内成瘤及皮下成瘤的肿瘤组织取出，提取基因组DNA后，对sgRNA的靶向区进行二代测序建库，通过比较前后sgRNA的丰度变化，筛选出脑转移相关候选基因。

2.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，所述脑转移相关基因为在脑转移灶与肿瘤原发灶中差异表达的基因，如表1中所示。

3.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，所述步骤S1包括以下步骤，

(a)提供核酸构建物Z1，所述的核酸构建物Z1具有以下结构：

L-N₂₀-R

其中，

L为位于脑转移相关基因的sgRNA的编码序列上游的左同源臂序列，

N₂₀为脑转移相关基因的sgRNA编码序列，

R为位于脑转移相关基因的sgRNA的编码序列下游的右同源臂序列；

(b)以所述的核酸构建物Z1为模板，进行PCR扩增，从而获得扩增产物；

(c)将所述扩增产物与经线性化的表达载体混合，并用Gibson assembly法进行连接，从而形成连接产物；

(d)将所述连接产物转化大肠杆菌，从而获得转化子，并从所述转化子中抽提质粒，从而获得所述的脑转移相关基因的sgRNA文库。

4.根据权利要求3所述的高通量筛选方法，其特征在于，所述左同源臂L的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示，右同源臂R的核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示。