[发明专利]一种高效生产2′-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株

说明书

本发明提供了一种高效生产2′‑岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株，属于合成生物学和微生物代谢工程技术领域。本发明以甘油为碳源，乳糖和L‑岩藻糖为底物，通过引入自组装短肽介导通路关键酶Fkp和FutC组装结合成酶复合物，从而减少代谢中间产物的流失提高产物生产效率，提高产物2′‑FL生产产量和产率。此外，还通过CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除大肠杆菌中与底物降解以及中间产物分流相关的一系列基因，同时加强代谢通路中的辅因子的循环再生进一步提高2′‑FL的产量。使得到的大肠杆菌工程菌株在3L发酵罐条件下分批补料64小时可积累30.5g/L的2′‑FL，摩尔产率为0.661mol2′‑FL/mol岩藻糖和0.495mol2′‑FL/mol乳糖。对于工业化生产2′‑FL具有重要意义。

技术领域

本发明涉及一种高效生产2′-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株，属于合成生物学和微生物代谢工程技术领域。

背景技术

人乳寡糖(Human milk oligosaccharides，HMOs)是母乳中第三大最丰富的固体成分，其在婴儿成长和发育中起着非常重要的作用。研究表明HMO具有益生元功效，可促进肠道益生菌如双歧杆菌的增值并抑制有害细菌的生长，从而调节调节肠道菌群。此外，HMO能够结合病原细菌并影响肠的屏障功能，进而调节局部和全身免疫。在HMOs中，岩藻糖基化低聚糖的比例约为50％。其中，2′-FL是含量最高且最为常见的一种岩藻糖基化的HMOs。2′-FL可以作为细菌或病毒粘附于上皮细胞的有效抑制剂。此外，2′-FL 同样可以作为益生元且在婴幼儿肠道发育和免疫成熟中起着重要作用。鉴于2′-FL在营养保健和药物应用中的潜在价值，高效且经济的生产2′-FL成为研究热点。

化学法合成2′-FL有其局限性，包括难以精确控制糖苷键，繁琐的活化和(去)保护步骤以及有毒试剂的使用等等。学者们更多的研究利用工程改造的微生物通过代谢工程和合成生物学策略来合成2′-FL。利用微生物细胞工厂生产岩藻糖基乳糖的代谢途径工程主要包括以下几个部分：(1)底物乳糖的吸收与代谢修饰；(2)胞内GDP-L-岩藻糖的供给；(3)岩藻糖基转移酶的表达和酶工程改造；(4)糖转运蛋白转运胞内产品至胞外。其中，胞内GDP-L-岩藻糖的有效供给和性状优良的岩藻糖基转移酶的引入对2′-FL 合成至关重要。因此，如何提高胞内GDP-L-岩藻糖的积累并提高对这一核苷酸前体的利用效率，同时发掘和改造优异岩藻糖基转移酶是高效生产2′-FL的关键。GDP-L-岩藻糖作为生产岩藻糖基化HMO的关键糖基供体可以有两种代谢途径获得：从头合成途径和补救途径。从头合成途径从葡萄糖或甘油等廉价可再生碳源出发，经过多步酶促反应最终合成GDP-L-岩藻糖。在大肠杆菌中利用葡萄糖为碳源需7步反应生成GDP-L-岩藻糖。补救途径通过引入脆弱拟杆菌Bacteriodes fragilis 9343来源的双功能酶岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶(Fkp)直接将外界提供的L-岩藻糖经过两步反应转化为GDP-L-岩藻糖。尽管使用葡萄糖或甘油作为底物的成本较为低廉，但是由于从头合成途径较长的催化步骤造成代谢通量和中间产物的流失，最终产率相对较低。

迄今为止，已经开发了多种微生物细胞代谢工厂用于生物合成2′-FL。最近的一项研究通过在重组枯草芽孢杆菌内构建GDP-L-岩藻糖补救途径并在此基础上引入Helicobacter pylori来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶(α-1,2-fucosyltransferases，FutC)将岩藻糖残基从GDP-L-岩藻糖供体转移到外源加入的乳糖受体上从而生成2′-FL。此外，考虑到底物的吸收和辅因子的供给，研究人员强化了相应底物的转运蛋白和辅因子再生途径相关的基因。最终，通过3L发酵罐的分批补料发酵获得了5g/L的2′-FL产量。岩藻糖和乳糖的转化率分别为0.85mol/mol和0.27mol/mol。最近有研究发现通过在Saccharomycescerevisiae内构建 GDP-L-岩藻糖的从头合成途径并引入了大肠杆菌来源的岩藻糖基转移酶WbgL实现2′-FL的微生物代谢生产。此外，通过将碳源供给由葡糖糖替换为木糖，酵母胞内的NADPH和ATP等合成2′-FL必要的辅因子供给更为充足使得2′-FL产量有了显著提高。