[发明专利]一种高效生产2′-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株

权利要求书

1.一种生产2′-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌，其特征在于，沉默表达大肠杆菌内源的与底物L-岩藻糖和乳糖以及关键中间产物GDP-L-岩藻糖分解代谢相关基因，异源表达GDP-L-岩藻糖补救途径合成关键酶和1,2-岩藻糖基转移酶，并加强表达鸟苷-肌苷激酶、鸟苷酸激酶和核苷酸二磷酸激酶中的一个或多个；

所述GDP-L-岩藻糖补救途径合成关键酶的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述1,2-岩藻糖基转移酶的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

鸟苷-肌苷激酶的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

鸟苷酸激酶的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

核苷酸二磷酸激酶的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述大肠杆菌内源的与底物L-岩藻糖和乳糖以及关键中间产物GDP-L-岩藻糖分解代谢相关基因为β-半乳糖苷酶的编码基因、L-岩藻糖异构酶和L-岩藻糖激酶的编码基因、D-阿拉伯糖异构酶的编码基因、L-鼠李糖异构酶的编码基因和UDP-葡萄糖脂载体转移酶的编码基因；

利用短肽对目的蛋白GDP-L-岩藻糖补救途径合成关键酶和1,2-岩藻糖基转移酶的C端或N端进行修饰；所述短肽为RIDD和RIAD；

利用RIDD对1,2-岩藻糖基转移酶的C端进行修饰；利用RIAD对GDP-L-岩藻糖补救途径合成关键酶的C端或N进行修饰；或利用两个RIAD对GDP-L-岩藻糖补救途径合成关键酶的C端和N端进行修饰；或利用两个RIAD对GDP-L-岩藻糖补救途径合成关键酶的N端进行修饰；

所述RIDD的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述RIAD的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，利用连接肽连接短肽与目的蛋白；所述连接肽为(GGGGS)₃，编码其的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

3.根据权利要求2所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述鸟苷-肌苷激酶、鸟苷酸激酶和核苷酸二磷酸激酶利用载体pACM4进行表达。

4.一种提高大肠杆菌2′-岩藻糖基乳糖生产能力的方法，其特征在于，在大肠杆菌中异源表达GDP-L-岩藻糖补救途径合成关键酶和1,2-岩藻糖基转移酶，利用RIDD对1,2-岩藻糖基转移酶的C端进行修饰，利用RIAD对GDP-L-岩藻糖补救途径合成关键酶的C端或N进行修饰；

所述GDP-L-岩藻糖补救途径合成关键酶的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述1,2-岩藻糖基转移酶的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述RIDD的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述RIAD的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

5.一种生产2′-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，是以权利要求1~3任一所述大肠杆菌工程菌为发酵微生物，以甘油为碳源，以L-岩藻糖和乳糖为底物合成2′-岩藻糖基乳糖，进行发酵生产2′-岩藻糖基乳糖。

6.权利要求1~3任一所述大肠杆菌工程菌在制备2′-岩藻糖基乳糖的应用。