[发明专利]一种真菌来源漆酶、其重组毕赤酵母工程菌及应用

说明书

本发明公开真菌来源的漆酶基因，涉及生物技术领域，漆酶基因为lac1，所述lac1的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示，或者lac1具有编码如SEQ.ID.NO.3所示氨基酸序列的碱基序列。本发明还提供携带上述漆酶基因表达载体的重组毕赤酵母工程菌株及其应用。本发明的有益效果在于：本发明异源表达了Trametes sp.中新鉴定的漆酶Lac1。本发明所获得的重组漆酶具有很好的热稳定性且具有良好的金属离子、有机溶剂及抑制剂耐受性，可催化靛蓝等染料脱色，在工业上具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种真菌来源漆酶、重组毕赤酵母工程菌及其应用。

背景技术

漆酶(Laccase，苯二醇：氧氧化还原酶，EC 1.10.3.2)属于多铜氧化酶家族(MCO)，能够氧化酚类和非酚类化合物，以水作为唯一的产物。由于具有宽底物谱、催化氧化过程中不产生任何有毒有害的物质、“绿色环保”等优势，近年来真菌漆酶的研究受到各国科研工作者的广泛关注。

真菌漆酶的作用底物超过200种，包括单体、二聚体、多酚类、氨基酚类、甲氧基苯酚类和金属复合物等。因此，真菌漆酶在工业上应用广泛，可用于染料脱色、造纸工业的生物漂白、检测酚类污染物生物传感器的研发、工业废水的处理等。

研究表明，真菌漆酶的底物范围受到其氧化还原电势的影响。至今，筛选获得的真菌漆酶氧化还原电势主要在0.49-0.70V。它们属于具有中/低氧化还原电势的真菌漆酶，其在催化具有高氧化还原电势的底物如染料脱色时，需要介体如ABTS、HBT等的参与。如公开号为CN109294936A的专利申请公开的漆酶需要在染料脱色过程中加入ABTS介体，而ABTS等价格昂贵，使用中会造成新的污染。因此，筛选具有高氧化还原电势(0.7V)的真菌漆酶，对于降低真菌漆酶的应用成本异常关键。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种真菌来源的新漆酶、并将新漆酶的基因转入毕赤酵母中，构建毕赤酵母工程菌株，获得具有较高氧化还原电势、可在无介体条件下直接氧化染料脱色的重组漆酶，降低漆酶用于染料等脱色的成本。

本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题：

真菌来源的漆酶基因，所述漆酶基因为lac1，所述lac1的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示，或者所述lac1具有编码如SEQ.ID.NO.3所示氨基酸序列的碱基序列。

优选地，所述lac1的全长序列如SEQ ID NO.1所示。

真菌来源的漆酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

SEQ ID NO.1中的DNA序列由2199个碱基组成，SEQ ID NO.2中的DNA序列由1551个碱基组成，SEQ ID NO.3由516个氨基酸组成，自N端第1-21位为信号肽序列，成熟氨基酸为495个氨基酸。

重组巴斯德毕赤酵母工程菌株，其携带真菌来源的漆酶基因表达载体，所述菌株的分类命名为Pichia pastoris-lac1，保藏编号：CGMCC No.21875，保藏日期：2021年3月8日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国.北京市朝阳区北辰西路。

有益效果：通过该重组毕赤酵母工程菌株发酵获得的重组漆酶，具有较高的比酶活、耐热性、氧化还原电势。对部分金属离子、有机溶剂、抑制剂具有一定的耐受性，在不加任何中间介体时能够有效降解靛蓝和活性蓝，与添加介体时的效果相近。本漆酶添加介质ABTS、HBT时能有效提高孔雀石绿的脱色率，为工业上提供了新的酶源。

同时氧化还原电势高的漆酶氧化能力强，能氧化更多的底物，包括木制素单体等。

重组毕赤酵母工程菌株的构建方法，包括以下步骤：以pPIC9K质粒为载体，构建lac1-pPIC9K表达载体，通过电转化将表达载体转入宿主毕赤酵母中，得到重组毕赤酵母工程菌株。