[发明专利]具有抗菌清除自由基和抑制酪氨酸酶活性的玫烟色苷B及制备方法

权利要求书

1.具有抗菌清除自由基和抑制酪氨酸酶活性的玫烟色苷B，其特征在于：所述玫烟色苷B为浅黄棕色粉末，结构式如下：

。

2. 根据权利要求1所述具有抗菌清除自由基和抑制酪氨酸酶活性的玫烟色苷B的制备方法，其特征在于操作步骤如下：

（1）制备固体培养物

将玫烟色虫草菌（Cordyceps fumosorosea）经过斜面菌种培养、二级固体种子培养和三级固体扩大培养，得到固体培养物；

（2）制备玫烟色苷B

用提取剂提取固体培养物中的有效成分，采用硅胶柱色谱和反相色谱方法纯化，得到浅黄棕色粉末状的玫烟色苷B。

3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于具体操作步骤如下：

（1）制备固体培养物

（1.1）斜面种子培养

将玫烟色虫草菌的水液菌种接种于土豆琼脂PDA斜面培养基，每个斜面接种10～30μL，于温度20～30℃、培养5～10d，收集孢子得到一级菌种；

（1.2）二级液体种子培养

将一级菌种用水配成浓度10⁵～10⁷个孢子/mL的孢悬液，按每个培养皿200～400μL接种至PDA平板上PDA板的规格为9×100mm，在20～30℃、恒温培养6～12天，收集孢子得二级菌种；

（1.3）三级固体扩大培养

将二级菌种用水配成浓度10⁵～10⁷个孢子/mL的孢悬液，按每平方厘米平板表面涂布1.5～5 μL孢悬液接种至PDA平板上，在20～30℃、恒温培养6～15天，收集培养物，得到固体培养物；

（2）制备玫烟色苷B

（2.1）固体培养物中有效成分的提取

将固体培养物在−50～130℃干燥，按重量体积比1g：0.5～5 mL在固体培养物中加入提取剂，40KHz超声提取20～200分钟；经0.20～2.5μm滤膜过滤或4000-15000转/分钟条件下离心，得滤液或离心上清；滤液或离心上清在真空度-0.1～-0.08 MP、温度10～80℃条件下减压蒸去提取剂，得到有效成分提取物；

（2.2）硅胶柱色谱初步分离纯化

按重量比1：1～10，将有效成分提取物与规格为100-200目的硅胶进行拌样；用规格为200-300目的硅胶填充柱子，利用湿法装柱，干法上样；用石油醚和乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，当乙酸乙酯浓度由0逐渐升到100%，总洗脱体积为3～8个柱体积；接着用乙酸乙酯和甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，当甲醇浓度由0逐渐升到50%，总洗脱体积为3～8个柱体积；收集乙酸乙酯：甲醇为50～30：5～25的洗脱液，在真空度-0.1～-0.08 MP、温度10～80℃条件下减压蒸去提取剂，得到初步纯化的有效成分；

（2.3）精制

采用反相高效液相色谱进行精制；色谱分离制备条件为：流动相A为超纯水，流动相B为甲醇；洗脱条件：0到30 min用10～95% 流动相B洗脱；进样体积30～300μL；柱温10～40℃、流速2～50 mL/min、检测波长为250～270 nm、色谱柱为反相C-18柱；收集第二个主峰对应的洗脱液，在真空度-0.1～-0.08 MP、温度10～80℃条件下减压蒸去提取剂，在低于170℃条件下干燥，得到浅黄棕色粉末状的玫烟色苷B。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，PDA培养基即马铃薯葡萄糖培养基，其配方为：6g马铃薯干粉，20g葡萄糖，15g琼脂，加水至1000mL。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，提取剂为按体积比由甲醇：乙酸乙酯为0～5：5～0配制成。