[发明专利]鉴定马铃薯黑胫病菌的方法及其引物和探针

说明书

本发明公开了鉴定马铃薯黑胫病菌的方法及其引物和探针。本发明具体地公开了马铃薯黑胫病菌(Dickeya solani，DS)特异性引物Ds4(SEQ ID No.1)、引物Ds5(SEQ ID No.2)，以及探针P‑Dsol(SEQ ID No.3)，本发明的引物对Ds4/Ds5能扩增供试的17株DS，得到491bp预期目标条带，检测灵敏度为40pg菌体DNA。探针P‑Dsol对供试17株DS表现为阳性扩增，检测灵敏度可达40fg菌丝DNA，比常规PCR高1000倍。本发明鉴定马铃薯黑胫病菌的方法具有快速、准确、特异性高、灵敏度高的特点，在球茎类样品的常规检测和疫情监测方面具有潜在的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及鉴定马铃薯黑胫病菌的方法及其引物和探针。

背景技术

马铃薯黑胫病菌(Dickeya solani，DS，D.solani)是一种新发现的对欧洲马铃薯生产造成严重威胁的细菌有害生物。Dickeya属病菌(原Erwinia chrysanthemi) 可引起世界上许多作物和观赏植物病害。20世纪70年代，Dickeya属病菌在荷兰马铃薯上首次报道(Maas Geesteranus,1972)，之后在欧洲多个国家也相继发生为害。但从2004年开始，一种新的病原菌，通过种薯贸易在欧洲和欧洲以外的许多马铃薯种植地区蔓延开来，引起严重的经济损失。2012年尚未被正式命名的‘Dickeya solani’被《molecular plantpathology》评为排名前十的植物病原细菌(John et al.,2012)。 2014年，van der Wolf等通过多位点序列分析(Multilocus sequence analysis，MLSA)、脂肪酸分析、DNA-DNA杂交等一系列实验，将该病菌命名为Dickeya solani(van der Wolf et al.，2014)。

由马铃薯黑胫病菌(Dickeya solani，DS)引起的马铃薯黑胫病(Blackleg ofpotato)是我国进境检疫性有害生物之一(2021年新增列入名录)。病菌主要侵染马铃薯茎基部和薯块，在马铃薯各个生长阶段均可发病(Sawiak et al.，2009)。病菌主要通过带菌种薯传播，由伤口或茎皮孔侵入组织，导致地下部块茎腐烂与地上部植株茎腐及叶片枯死，严重时全株枯死。维管束组织自茎基部开始变褐，逐渐延至上部，最终导致茎基部中空坏死(Toth et al.，2011；Sarris et al.，2011)。

Dickeya solani在马铃薯上危害十分严重，正式命名以前就引起多个国家关注，风险分析后列入检疫性有害生物，其危害程度远远高于Dickeya属内的其他种。随着农产品贸易及种植资源交流的发展，病菌随农产品和植物产品在贸易中传入的风险增加，会对我国农业发展和农产品贸易构成严重的威胁。马铃薯是仅次于水稻、小麦、玉米的世界第四大粮食作物。我国是马铃薯生产大国，种植面积与产量均居世界第一，该病菌一旦传入，将使我国马铃薯种植业遭受巨大的损失。近年来我国的种苗贸易逐年递增，各地口岸已从进境种球上多次截获该有害生物。因此，为了保护我国相关产业安全，防止有害生物的传入和疫情扩散，十分必要建立一套快速、准确、特异、灵敏、方便、可靠、稳定的分子检测方法，可在球茎样品的常规检测、分离株诊断和疫情监测方面发挥作用，为进口检疫提供可靠、有效的技术保障。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何鉴定或辅助鉴定马铃薯黑胫病菌(Dickeyasolani，DS)。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了马铃薯黑胫病菌的特异性引物对，所述引物对由引物Ds4和引物Ds5组成；所述引物Ds4为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；所述引物Ds5为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子。

所述引物对名称为Ds4/Ds5。

所述引物Ds4为正向引物，所述引物Ds5为反向引物。