[发明专利]一种实时快速检测大肠杆菌紫外照射效果的方法

说明书

本发明属于分子生物学检测技术领域，特别涉及一种双通道探针法荧光定量PCR实时快速检测大肠杆菌紫外照射效果的方法；包含PCR扩增和荧光定量测量两部分；包含短片段引物对P1，经所述PCR扩增后，由所述荧光定量测量得CT短；包含长片段引物对P2，经所述PCR扩增后，由所述荧光定量测量得CT长；所述实验组还包含ΔCT=CT长‑CT短；ΔCT与大肠杆菌样品杀灭对数值K存在如下关系，K=2.156×ΔCT‑2.164±b，b为≤10任一实数。ΔCT≥检测限值1.5时，判定样品受到紫外照射；ΔCT检测限值1.5时，判定样品未受到紫外照射。本发明具有安全、迅速、灵敏和高效的特点。

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，特别涉及一种双通道探针法荧光定量PCR实时快速检测大肠杆菌紫外照射效果的方法。

背景技术

大肠杆菌是人和许多动物肠道中数量最多的一种细菌，在一定条件下可引起肠道外感染，是条件致病菌。大肠杆菌对热有较强的抵抗力，在温度较低粪便中也可存活较长的时间，在自然界的水中可存活数周至数月，该菌对抗生素敏感，但易耐药。紫外线（UV）照射能破坏细菌DNA的双螺旋结构，影响其复制和转录功能，起到对细菌灭活的作用；通过紫外照射灭活环境中的大肠杆菌可以防止食品和环境污染，阻止疾病传播。除此之外，紫外线（UV）照射可以引起基因突变，同样可以用于优良大肠杆菌有益菌种选育，期间也需要对菌种的照射效果进行评价。

发明人发现的：目前还没有报道实时快速检测大肠杆菌紫外照射效果的方法。现有技术中彗星电泳检测法，可用于检测真核细胞的DNA损伤，但需经过凝胶制备、电泳、染色以及图像采集等过程，操作复杂，且实验用的染料多为强诱变剂溴化乙锭，会对操作人员健康造成威胁；常用的基于抗体免疫检测嘧啶二聚体的方法检测，如ELISA以及免疫印迹等，但这些方法的技能要求较高，耗时长，无法对大肠杆菌紫外照射效果进行快速检测，因而市场上急需一种进行实时快速检测的方法；常用技术中平板培养法是通过将大肠杆菌样品在固体培养基平板上进行培养，将未经过紫外照射的大肠杆菌作为对照组，将经过紫外照射的大肠杆菌作为实验组，经过紫外照射的实验组大肠杆菌平板上菌落减少；该方法需要对大肠杆菌进行培养，耗时24-48h，无法达到快速检测的目的。

发明内容

为解决背景技术中提及的至少一个问题，本发明基于双通道探针法荧光定量PCR技术提供一种实时快速检测大肠杆菌紫外照射效果的方法，我们提出的方法针对大肠杆菌紫外照射效果具有较强的特异性和较高的灵敏度，能够用于快速检测紫外照射对大肠杆菌杀菌率。

一种实时快速检测大肠杆菌紫外照射效果的方法，通过双通道探针法荧光定量PCR技术检测大肠杆菌的紫外照射效果，所述荧光定量PCR技术包含若干实验组；所述荧光定量PCR技术包含PCR扩增和荧光定量测量两部分；所述实验组包含短片段引物对P1，经所述PCR扩增后，由所述荧光定量测量得CT短；所述实验组包含长片段引物对P2，经所述PCR扩增后，由所述荧光定量测量得CT长；

不同紫外照射条件处理所述大肠杆菌样品的ΔCT=CT长-CT短；所述ΔCT与所述大肠杆菌样品杀灭对数值K存在如下关系，K=2.156×ΔCT-2.164；

所述紫外照射条件包含不同的照射时间及照射强度；所述ΔCT为荧光信号CT值。

所述检测方法包括以下反应步骤：

步骤1，用相应培养基培养得到所需大肠杆菌培养液；

步骤2，定量取得一定体积V所述大肠杆菌培养液作为第一培养液，不做额外处理；定量取得若干份一定体积V所述大肠杆菌培养液分别作为第二培养液、第三培养液.......和第N培养液，在一定紫外强度下照射一段时间t；

步骤3，将所述第一、第二、第三......和第N培养液分别核酸抽提纯化，分别作为第一、第二、第三......和第N实验组定量PCR的模板；