[发明专利]一种固液结合制备普卡那肽的方法

权利要求书

1.一种固液结合制备普卡那肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)采用Wang树脂为固相载体，用Fmoc-Leu-OH与之偶联反应制备得到Fmoc-Leu-Wang树脂，再按普卡那肽序列依次与Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(tButhio)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Boc-Asn(Trt)-OH偶联连接，得到普卡那肽线性肽肽树脂：Boc-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-⁴Cys(tButhio)-Glu(OtBu)-Leu-⁷Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-VaL-Ala-¹²Cys(Mmt)-Thr(tBu)-Gly-¹⁵Cys(Trt)-Leu-Wang树脂；

(b)采用脱保护试剂脱掉4位半胱氨酸侧链巯基保护基tButhio，得到Boc-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-⁴Cys-Glu(OtBu)-Leu-⁷Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-

Val-Ala-¹²Cys(Mmt)-Thr(tBu)-Gly-¹⁵Cys(Trt)-Leu-Wang树脂，然后再与DTNB反应，得到

Boc-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-⁴Cys(Npys)-Glu(OtBu)-Leu-⁷Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-¹²Cys(Mmt)-Thr(tBu)-Gly-¹⁵Cys(Trt)-Leu-Wang树脂；

(c)0.5-1%TFA/DCM条件下，环化得到肽树脂Boc-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-⁴Cys-Glu(OtBu)-Leu-⁷Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-VaL-Ala-¹²Cys-Thr(tBu)-Gly-¹⁵Cys(Trt)-Leu-Wang树脂（环4-12）；

(d)肽树脂经裂解得到脱保护肽，脱保护肽溶解后，经再次氧化、纯化、冻干得普卡那肽。

2.根据权利要求1所述的制备普卡那肽的方法，其特征在于：步骤（a）中所述固相载体Wang树脂或CTC树脂的替代度为0.2-0.9mmol/g。

3.根据权利要求1所述的制备普卡那肽的方法，其特征在于：步骤（a）的具体操作步骤为：Wang树脂经与Fmoc-Leu-OH偶联得到Fmoc-Leu-Wang树脂，脱除Fmoc保护后，以2-5倍的投料比加入相应的Fmoc保护氨基酸进行偶联反应，每一个偶联反应均是在缩合剂的存在下进行的固相接肽反应，每一步偶联反应均以Kaiser试剂检测反应终点，反应完毕后用脱保护试剂脱除Fmoc，再与下一个Fmoc保护氨基酸进行偶联反应；重复操作直至合成得到得到普卡那肽线性肽肽树脂：Boc-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys(tButhio)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-VaL-Ala-Cys(Mmt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Leu-树脂。

4.根据权利要求3所述的制备普卡那肽的方法，其特征在于：所述脱保护试剂为20%哌啶的DMF溶液（体积比）；偶联反应中所用的缩合剂为以下组合DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/ DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA的一种。