[发明专利]一种检测杀螟硫磷的荧光比率型免疫分析方法

说明书

本发明提供了一种杀螟硫磷的荧光比率型免疫分析方法。通过在微孔板中包被杀螟硫磷包被原，以杀螟硫磷纳米抗体融合碱性磷酸酶(Nb‑ALP)识别及信号放大元件，样品中杀螟硫磷与板上包被原竞争结合Nb‑ALP，随后洗去多余的药物和抗体，连接在微孔板的Nb‑ALP催化随后加入的L‑抗坏血酸‑2‑磷酸三钠盐(AAP)水解生成抗坏血酸(AA)；随后再向其中加入邻苯二胺(OPD)，壳聚糖修饰的铂纳米颗粒(Ch‑Pt NPs)，AA与OPD竞争性地被具有类氧化特性的Ch‑Pt NPs催化氧化。其中，OPD被氧化为荧光物质2,3‑二氨基酚(DAP)，荧光发射峰为568nm；而氧化态AA与OPD反应生成喹喔啉衍生物(DFQ)，荧光发射峰为430nm；因此，样品中杀螟硫磷的含量更为灵敏地反映在430nm与568nm的荧光比值上，实现对杀螟硫磷农药高灵敏检测的目的。

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，更具体地，涉及了一种检测杀螟硫磷的荧光比率型免疫分析方法。

背景技术

农药是指在农业上用于防治病虫及调节植物生长、除草等药剂。杀螟硫磷作为一种常见的有机磷农药，已在蔬菜水果种植中作为杀虫剂得到广泛应用。然而，由于杀螟硫磷的广泛使用和不当处理而造成的农药污染，已对环境和民众健康造成一定的负面影响。杀螟硫磷作为有机磷农药的一种，能够抑制生物体内乙酰胆碱酯酶活性，即使浓度比较低，也会抑制胆碱导致中枢神经传递受损，进一步损害人体健康；长期低浓度积累，也可能会造成致命后果。因此，正确管理和使用农药，准确评价农药污染是保障人体健康、保障食品质量安全的首要要求。传统的采用气相色谱、高效液相色谱、质谱等金标准方法对农产品中的农药残留虽然可以进行高精度测定痕量的农药残留，但是这些方法对仪器设备的要求高、耗时长，且需要比较专业的操作技巧，限制了其现场的应用，因此，开发出快速、简便、选择性检测杀螟硫磷的替代方法具有重要意义。

基于抗原抗体特异性结合反应的ELISA方法具有成本低、操作简便、特异性高、检测通量高等优点，在食品污染物快速筛查上备受关注。然而，传统基于比色测定的ELISA，由于灵敏度一般，在分析复杂基质中痕量物质时往往受到限制。目前，利用杀螟硫磷的免疫分析方法主要基于比色测定的传统ELISA方法。如：Liu等建立了一种基质固相分散体和ELISA方法，对杀螟硫磷IC₅₀为120.7ng/mL(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for theDetermination of Five Organophosphorus Pesticides in Camellia Oil,Liu etal.Journal of Food Protection,2014,77(7):1178-1183)；Li等基于制备的有机磷农药单克隆抗体建立的ELISA，其中杀螟硫磷IC₅₀为164.84ng/mL(Immunochemical andmolecular characteristics of monoclonal antibodies against organophosphoruspesticides and effect of hapten structures on immunoassay selectivity,Li etal.Food and Agricultural Immunology,2015,26(1):109-119)；然而在国标(GB2763-2019)中，杀螟硫磷食品中的最大残留限量低至50ng/mL，考虑到样品基质效应带来的干扰，现有的杀螟硫磷ELISA方法的灵敏度不能达到检测要求。因此，如何开发更高灵敏度的免疫检测方法是有关学者一直致力研究的问题。

目前为止，有关的免疫检测方法增敏的策略报道很多。其中一种策略是，引入新的信号输出体系，将抗原抗体间分子识别活动转化为更灵敏的信号被检出。例如已经建立的荧光免疫分析、化学发光免疫分析、电化学免疫分析技术等。由于其高灵敏度、简便性，荧光免疫分析技术作为传统基于比色测定的ELISA的重要补充，具有广阔应用前景。然而，当前大部分荧光免疫分析方法一样是基于单一荧光强度的测定“turn-off”或“turn-on”，荧光信号易受外部环境因素的影响，导致信噪比低、精密度低。而且目前尚未有关于杀螟硫磷的荧光比率型免疫分析方法报道。