[发明专利]一种改良L-15培养基及其在培养对虾肌肉细胞中的应用

说明书

本发明公开了一种改良L‑15培养基及其在培养对虾肌肉细胞中的应用。所述的改良L‑15培养基含有10mmol/L丙氨酸、3mmol/L甘氨酸、3mmol/L丝氨酸、1.5mmol/L组氨酸、0.5mmol/L赖氨酸、1.5mmol/L精氨酸、1.5mmol/L缬氨酸、1mmol/L苏氨酸、0.5mmol/L蛋氨酸、0.5mmol/L亮氨酸、5mmol/L天冬氨酸、0.5mmol/L谷氨酰胺、1mmol/L苯丙氨酸；还含有牛磺酸、脯氨酸、谷氨酸、胎牛血清、双抗，pH值为7.2‑7.4。本发明的改良L‑15培养基提高了南美白对虾原代肌肉细胞的存活率和贴壁率，改善细胞生长状态。

技术领域

本发明涉及一种改良L-15培养基及其在培养对虾肌肉细胞中的应用。

背景技术

对虾细胞系的建立是研究病毒致病机理、分离纯化对虾病毒、发展有效诊断试剂的基础。对虾细胞系的成功建立不仅可以精确控制实验条件，还可以大大降低实验成本，获得更好的研究结果。培养基是培养细胞不可缺失的一部分，现有的培养基还不能满足对虾细胞建系，所以细胞培养基的优化是虾细胞成功建系的关键之一，这对研究虾细胞体外培养具有重要意义。

目前没有专门针对对虾的细胞培养基，对虾细胞培养主要还是采用改良的哺乳动物或昆虫细胞培养基，例如L-15、M199、RPMI、Grace等。其中L-15和M199培养基已证明能够支持对虾部分组织细胞的生长，比如卵巢细胞、性腺细胞等。肌肉占对虾身体的大部分，研究肌肉细胞对对虾的研究和发展具有重要意义。

中国发明专利CN103232969 B公开了一种对虾细胞培养基的保存液，以1.5×L-15培养基为基础培养基，并添加体积比为10％的对虾肌肉提取液、5g/L氯化钠、2g/L葡萄糖、1g/L碳酸氢钠、10μg/mL牛磺酸、10μg/mL脯氨酸、100IU/mL青霉素钠和100μg/mL硫酸链霉素；pH值为7.3-7.5。

然而，上述专利对细胞的氨基酸需求没有精确测定，仅1.5倍扩大L-15培养基所有成分。并且，其原代细胞提取方法为组织块培养，需培养几个小时甚至几天后才能得到细胞，且在培养过程中，组织块培养法更容易受到污染。该专利的培养基工作液还加入了20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和20ng/mL表皮生长因子(EGF)，大大增加了成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改良L-15培养基及其在培养对虾肌肉细胞中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种改良L-15培养基，含有10mmol/L丙氨酸、3mmol/L甘氨酸、3mmol/L丝氨酸、1.5mmol/L组氨酸、0.5mmol/L赖氨酸、1.5mmol/L精氨酸、1.5mmol/L缬氨酸、1mmol/L苏氨酸、0.5mmol/L蛋氨酸、0.5mmol/L亮氨酸、5mmol/L天冬氨酸、0.5mmol/L谷氨酰胺、1mmol/L苯丙氨酸，培养基其他原料的种类和浓度与L-15培养基相同；

所述的改良L-15培养基还含有2.5mmol/L牛磺酸、50mmol/L脯氨酸、20mmol/L谷氨酸、10％胎牛血清(FBS)、100IU/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素，pH值为7.2-7.4。

上述的改良L-15培养基可以用于培养对虾肌肉细胞；

具体地，取上述的改良L-15培养基，加入培养基10％体积的对虾肌肉细胞提取液，在27℃恒温、5％CO₂中培养，每隔3d换一次培养基；

所述的更换培养基，是将培养体系离心(1000r/min离心5min)，取沉淀物，弃去培养基，加入新培养基；

所述的对虾肌肉细胞提取液，由以下步骤制得：