[发明专利]一种DNA及其甲基化水平的检测试剂盒和制备方法、应用

说明书

本发明涉及DNA的检测分析领域，特别涉及一种DNA及其甲基化水平的检测试剂盒和制备方法、应用。该检测试剂盒包括ssDNA1修饰的壳聚糖纤维、ssDNA2修饰的金纳米粒子；ssDNA1为与目的DNA一端序列互补的ssDNA；ssDNA2为与目的DNA另一端序列互补的ssDNA；壳聚糖纤维为带有荧光标记的壳聚糖纤维。本发明检测方法对p16及其甲基化显示了高的灵敏性和选择性，检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确，检测手段简单。

技术领域

本发明涉及DNA的检测分析领域，特别涉及一种DNA及其甲基化水平的检测试剂盒和制备方法、应用。

背景技术

DNA甲基化通常发生在CpG岛上，是在DNA甲基化转移酶的催化作用下，在胞嘧啶环的第五位碳上加入一个甲基化基团，形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的过程。DNA甲基化在基因表达和调控、维持基因组稳定性、X染色体失活和哺乳动物细胞方面扮演着重要角色。肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态的变化可导致肿瘤抑制基因的转录沉默，因此被视为各种疾病和癌症的标志。已经开发了许多传统的DNA甲基化检测方法，但是这些方法都有一定的局限性，比如亚硫酸氢盐的处理可能会由于氧化损伤导致DNA降解，这对于甲基化的检测可能会产生误导性的结果；HPLC和MS只能测量整体甲基胞嘧啶的含量，且需要大量输入DNA和复杂仪器。

荧光检测方法由于其灵敏度高、操作简单，目前正在获得越来越多的关注。然而，目前荧光传感器具有一些特殊的局限性，如在复杂环境中稳定性低、与背景荧光光谱相重叠等等。此前我们已经开发了基于聚二乙炔微米管对miRNA-21进行检测的光波导传感器，但是其对于DNA甲基化检测的应用尚未探究过。此外，合成聚二乙炔微米管的步骤繁琐且成本高昂，因此开发一种新型的基于荧光的光波导传感器对DNA甲基化进行高特异性和高灵敏度地检测仍然是一项非常有挑战性的任务。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种DNA及其甲基化水平的检测试剂盒和制备方法、应用。本发明采用了壳聚糖天然高分子材料，本发明制备了一维壳聚糖纤维，并结合荧光共振能量转移机制、DNA的三明治杂交、浓缩富集效应等，构筑了高灵敏度、高选择性的新型生物传感器用于p16等DNA及其甲基化的检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种DNA的检测试剂盒，包括ssDNA1修饰的壳聚糖纤维、ssDNA2修饰的金纳米粒子；ssDNA1为与目的DNA一端序列互补的ssDNA；ssDNA2为与目的DNA另一端序列互补的ssDNA；壳聚糖纤维为带有荧光标记的壳聚糖纤维。

在本发明提供的具体实施例中，荧光标记为FITC。但荧光标记种类并非限定于此，本领域技术人员认可的种类均在本发明的保护范围之内。

在本发明提供的具体实施例中，目的DNA为p16。但DNA的种类并非限定于此，本领域技术人员认可的种类均在本发明的保护范围之内。

本发明方法基于目标分子p16与ssDNA1、ssDNA2的杂交，形成三明治结构，通过ssDNA2修饰的金纳米粒子，使壳聚糖纤维端头光波导荧光信号淬灭。随着浓缩富集反应，低浓度的p16就可产生高的信号，从而实现目标的检测。该检测方法对p16及其甲基化显示了高的灵敏性和选择性，检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。

本发明还提供了该检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

将壳聚糖、荧光素溶于溶剂中，得到壳聚糖溶液，浓缩，制成纤维；除去纤维表面的溶剂，干燥，表面修饰环氧基团，得到环氧修饰的壳聚糖纤维；氨基修饰的ssDNA1与环氧修饰的壳聚糖纤维发生反应，得到ssDNA1修饰的壳聚糖纤维；

将金纳米粒子与巯基修饰的ssDNA2进行孵育，得到ssDNA2修饰的金纳米粒子。

作为优选，以g/mg/mL计，壳聚糖溶液中壳聚糖、荧光素与溶剂的比例为(0.5～5)：(1～10)：(10～50)。