[发明专利]一种固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法

说明书

本发明提供一种固定化细胞高效生产α‑熊果苷的方法，步骤如下：将大肠杆菌Escherichia coli IFE‑amy 637在含有卡那霉素的种子培养基中，于30℃～37℃、100rpm～200rpm培养至对数生长中期，获得种子液，将新鲜培养的种子液以体积浓度5％的接种量接种到5m³的发酵罐，经高密度发酵获得生产α‑熊果苷所用的酶催化剂(菌体)；利用湿菌体制备固定化细胞；利用固定化细胞进行催化反应获得成品。本发明方法利用固定化细胞生产α‑熊果苷，提高了α‑熊果苷的生产效率，缩短了工艺流程，降低了生产成本，减少了“三废排放”。

技术领域

本发明属于α-熊果苷制备技术领域，具体涉及一种固定化细胞高效生产α- 熊果苷的方法。

背景技术

α-熊果苷，又名熊果素，化学式为C₁₂H₁₆O₇，是一种由杜鹃花科植物熊果叶中萃取出的成分，能够通过抑制体内酪氨酸酶的活性，阻止黑色素的生成，从而减少皮肤色素沉积，祛除色斑和雀斑，同时还有杀菌、消炎的作用，主要应用于化妆品中。

α-熊果苷，作为源自植物的天然酪氨酸结构类似物，能够有效抑制酪氨酸酶的活性，是一种天然、高效的酪氨酸酶抑制剂，目前已被广泛用于化妆品和医药领域：(1)在化妆品行业，α-熊果苷是一种重要的皮肤美白原料，作用机理如下所示，其不仅对皮肤的雀斑、老人斑、黄褐斑有消褪作用，而且对皮肤的滋润、皮肤灼伤后的愈合和粉刺等也颇有疗效；(2)在医药方面，α-熊果苷对于人体色素沉着病和黑色素瘤也具有特殊的疗效，是临床上应用最为广泛的治疗药物。

获得高催化活性的生物酶是实现α-熊果苷工业化生产的关键技术所在，但相关生产技术一直以来被国外化工巨头所垄断，如荷兰皇家帝斯曼集团。在生物法合成α-熊果苷方面，已有研究表明通过植物细胞培养技术，包括棘胸蛙、骆驼蓬人参等植物细胞培养物，以对苯二酚为底物，能合成细胞干重7％的α-熊果苷，对苯二酚转化率最高为80％。另外，更多研究着手于微生物的酶法转化生产α- 熊果苷。2002年，日本研究小组报道用野油菜黄单胞菌wu-9701冻干细胞作为生物催化剂，麦芽糖作为葡萄糖供体，对苯二酚的最大转化率为93％。2013年，也有国内课题组报道利用嗜麦芽黄单胞菌，以麦芽糖为糖基供体，α-熊果苷产量提高到30.6g/L，摩尔转化率达93.6％。可见，采用微生物细胞或相应的酶制剂法生产α-熊果苷，具有周期短、得率高和产率高的特点，可规模化生产。

在实际生产过程中，微生物酶制剂通过发酵获得，发酵废液中，含有大量的糖类、蛋白质等，排放的废水中COD含量较高，这大幅增加了该产品的生产成本。

发明内容

本发明针对上述缺陷，提供一种采用固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法，该方法于固定化过程中加入甘油葡萄糖苷或海藻糖作为酶稳定剂，提高了制备得到的固定化细胞生产α-熊果苷过程中的利用批次和酶活力存活时间。

本发明提供如下技术方案：一种固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法，包括以下步骤：

S1：将大肠杆菌Escherichia coli IFE-amy 637在含有卡那霉素的种子培养基中，于30℃～37℃、100rpm～200rpm培养至对数生长中期，获得种子液；

S2：将新鲜培养的种子液以体积浓度5％的接种量接种到5m³的发酵罐，向所述发酵罐中装入2.5m³的发酵培养基，于30℃～37℃，培养4h～6h后；加入α-乳糖，控制发酵温度在22℃～25℃，继续发酵12h～18h，得到生产α-熊果苷的催化剂，经高速离心，获得菌体，将所述菌体加0.9％生理盐水洗涤3次，得到的湿菌体，将所述湿菌体保存于-18℃备用；