[发明专利]一种固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法

权利要求书

1.一种固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将大肠杆菌Escherichia coli IFE-amy 637在含有卡那霉素的种子培养基中，于30℃～37℃、100rpm～200rpm培养至对数生长中期，获得种子液；

S2：将新鲜培养的种子液以体积浓度5％的接种量接种到5m³的发酵罐，向所述发酵罐中装入2.5m³的发酵培养基，于30℃～37℃，培养4h～6h后；加入α-乳糖，控制发酵温度在22℃～25℃，继续发酵12h～18h，得到生产α-熊果苷的催化剂，经高速离心，获得菌体，将所述菌体加0.9％生理盐水洗涤3次，得到湿菌体，将所述湿菌体保存于-18℃备用；

S3：取0.1kg的湿菌体悬浮于0.5L生理盐水，加入20g酶稳定剂，形成的菌悬液与2L含有海藻酸钠的水溶液混匀，然后继续加入聚乙烯醇，充分混合后，将混合液缓慢喷雾至20L饱和硼酸溶液中，室温中放置12h使其硬化，倾去溶液部分，采用生理盐水洗涤3次得到的细胞，得到固定化细胞，于4℃冰箱保存备用；所述S3步骤中的酶稳定剂为甘油葡萄糖苷；

S4：按S3步骤放大制备固定化细胞，取500kg固定化细胞，加入5t去离子水，加入2.5t蔗糖，继续加入25kg对苯二酚，于30℃下反应，反应过程中，每隔1h添加20kg对苯二酚，共进行转化反应10h，在10h的转化时间内，连续累计投入对苯二酚底物205kg，最终测定获得491kg的α-熊果苷；

S5：反应结束后，将催化液静置，过100目筛网，滤液为浅黄色透明澄清液体，将所述滤液通入树脂柱，吸附产品，上样结束后，加入15m³纯水冲洗树脂，随后采用16m³、40％体积分数的乙醇洗涤，获得无色澄清洗脱液，其中含α-熊果苷478kg；进一步于60℃、-0.9MPa下减压浓缩，至α-熊果苷的质量分数含量为50％，降温结晶，同时保持搅拌，降温至室温后，通入5℃冷冻水，保温12h，得到结晶溶液；

S6：将所述结晶溶液经离心后，获得α-熊果苷固体，将所述α-熊果苷固体于70℃下真空干燥8h，最终获得247kg的α-熊果苷成品。

2.根据权利要求1所述的一种固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法，其特征在于，所述种子培养基的成分为含有5g/L的酵母粉、10g/L的蛋白胨、8.9g/L的NaHPO₄·12H₂O、3.4g/L的KH₂PO₄、2.67g/L的NH₄Cl、0.71g/L的Na₂SO₄、0.49g/L的MgSO₄·7H₂O、50mg/L的卡那霉素的去离子水溶液。

3.根据权利要求1所述的一种固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法，其特征在于，所述种子培养基的酸碱度为pH 7.0。

4.根据权利要求1所述的一种固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分为含有10g/L的蛋白胨、5g/L的酵母提取粉、15g/L甘油、9g/L Na₂HPO₄、3.4g/L KH₂PO₄、3g/L NH₄Cl、0.71g/L Na₂SO₄、5g/L MgSO₄的去离子水溶液。

5.根据权利要求1所述的一种固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法，其特征在于，所述发酵培养基的酸碱度为pH 6.5-7.5。

6.根据权利要求1所述的一种固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法，其特征在于，所述步骤S2中加入的α-乳糖的终浓度为5g/L-20g/L。

7.根据权利要求1所述的一种固定化细胞高效生产α-熊果苷的方法，其特征在于，所述S3步骤中加入海藻酸钠后的混合溶液中，所述海藻酸钠的终浓度为15g/L。