[发明专利]一种人肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组2型VP1重组蛋白、多克隆抗体及其应用

说明书

本发明公开了一种人肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组2型VP1重组蛋白、多克隆抗体及其应用。本发明的技术方案要点为：提供了一种EV‑A71和CV‑A2VP1重组蛋白纯化、多克隆抗体制备的方法，并应用制备的小鼠多克隆抗体建立了蛋白质免疫印迹和免疫过氧化物酶单层细胞试验检测EV‑A71和CV‑A2的方法。本发明所述的这种EV‑A71和CV‑A2VP1蛋白纯化方法简便快捷、操作性强、回收率高，多克隆抗体制备方法无需免疫佐剂，节约了成本，制备的小鼠多克隆抗体能检测细胞样品中的EV‑A71和CV‑A2，特异性和重复性好。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种人肠道病毒71型(humanenterovirus A71,EV-A71)和柯萨奇病毒A组2型(coxsackievirus A2,CV-A2)VP1重组蛋白、多克隆抗体及其应用。

背景技术

人肠道病毒71型(human enterovirus A71,EV-A71)和柯萨奇病毒A组2型(coxsackievirus A2,CV-A2)都属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)A组肠道病毒(Enterovirus A)。EV-A71和CV-A2感染都能引起手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)。EV-A71感染引起的HFMD大多是自限性的，但有一些感染可以引起严重的神经系统疾病，如无菌性脑膜炎、脑干脑炎，甚至死亡。CV-A2感染主要引起疱疹性咽峡炎，较少引起神经系统疾病，但有报道CV-A2感染会引起小儿麻痹症样麻痹、合并神经表现、心肌炎、严重脑炎甚至死亡。

EV-A71和CV-A2都是单股正链RNA病毒。EV-A71基因组长约7.5kb，只有一个编码了2193个氨基酸的开放阅读框(open reading frame,ORF)，两端分别为5′和3′非翻译区(untranslated regions,UTRs)。在EV71复制过程中，其编码的多聚蛋白被细分为P1、P2和P3区域：P1编码四种结构蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)，而P2和P3编码七种非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)。CV-A2基因组长约7.4kb，编码约2190个氨基酸的多聚蛋白，结构与EV-A71类似。

肠道病毒的VP1蛋白是主要的病毒中和决定因素。VP1的核苷酸序列分析可以替代中和试验分型方法，用来区分肠道病毒的血清型。EV-A71的VP1蛋白含有297个氨基酸，显示出与病毒血清型相应的完整的遗传多样性，可作为EV-A71血清型分类的依据。EV-A71的VP1蛋白可诱导对EV71的有效免疫保护，是抗EV71感染的理想候选蛋白，其N末端可能具有重要的中和抗体决定簇，可能作为急性感染诊断和治疗抗体的的靶点。CV-A2全长VP1核苷酸序列有885bp，编码295个氨基酸。目前关于CV-A2 VP1蛋白的研究报道较少。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种人肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组2型VP1重组蛋白、多克隆抗体及其应用，本发明分别扩增了EV-A71和CV-A2的全长VP1基因并进行了原核表达，采用超声破碎、差速离心、氯化钾染色切胶回收、液氮研磨等简便易行的方法分别对EV-A71 VP1重组蛋白和CV-A2 VP1重组蛋白进行了纯化，通过腹腔注射免疫小鼠成功地制备了小鼠抗EV-A71 VP1多克隆抗体和CV-A2 VP1多克隆抗体，并应用多克隆抗体通过蛋白质免疫印迹(Western blot)和免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidasemonolayer assay,IPMA)检测EV-A71 VP1和CV-A2 VP1在病毒感染人横纹肌肉瘤细胞RD中的表达。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案：

一种人肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组2型VP1重组蛋白，其特征在于：该人肠道病毒71型VP1重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；柯萨奇病毒A组2型VP1重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。