[发明专利]一种人肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组2型VP1重组蛋白、多克隆抗体及其应用

权利要求书

1.一种人肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组2型VP1重组蛋白，其特征在于：该人肠道病毒71型VP1重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；柯萨奇病毒A组2型VP1重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

2.一种权利要求1所述的人肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组2型VP1重组蛋白的制备方法，其特征在于具体步骤为：

步骤S1：构建携带EV-A71 VP1基因的重组质粒pET-28a(+)EV-A71 VP1和携带有CV-A2VP1基因的重组质粒pET-28a(+)CV-A2 VP1；

步骤S2：将重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，诱导表达EV-A71 VP1重组蛋白和CV-A2 VP1重组蛋白，对EV-A71 VP1重组蛋白和CV-A2 VP1重组蛋白分别进行纯化即得人肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组2型VP1重组蛋白。

3.根据权利要求2所述的人肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组2型VP1重组蛋白的制备方法，其特征在于步骤S2的具体过程为：将含有EV-A71 VP1重组蛋白和CV-A2 VP1重组蛋白的细菌裂解液，分别用超声波破碎后进行差速离心，重复四次，最后3000×g离心沉淀包涵体，用3/80初始菌液体积重悬；用12％(m/V)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离上述重悬液中的EV-A71 VP1重组蛋白和CV-A2 VP1重组蛋白，用冰冷的5％(m/V)氯化钾水溶液对分离胶进行漂染，切胶回收乳白色蛋白条带；在回收胶中加入适量磷酸盐缓冲液后用液氮研磨三次，最终获得纯化的EV-A71 VP1重组蛋白和CV-A2 VP1重组蛋白。

4.一种基于人肠道病毒71型VP1重组蛋白的多克隆抗体及基于柯萨奇病毒A组2型VP1重组蛋白的多克隆抗体。

5.一种权利要求4所述的基于人肠道病毒71型VP1重组蛋白的多克隆抗体及基于柯萨奇病毒A组2型VP1重组蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：将纯化后的EV-A71 VP1重组蛋白和CV-A2 VP1重组蛋白分别作为抗原通过腹腔注射免疫Balb/c小鼠，制备小鼠多克隆抗体anti-EV-A71 VP1和anti-CV-A2 VP1。

6.一种权利要求4所述的基于人肠道病毒71型VP1重组蛋白的多克隆抗体及基于柯萨奇病毒A组2型VP1重组蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征在于具体过程为：将纯化的EV-A71 VP1重组蛋白和CV-A2 VP1重组蛋白分别免疫12周龄Balb/c小鼠，首次免疫用200μL剂量，以后每隔三到四周加强免疫，加强免疫用100～150μL剂量，免疫均采用腹腔注射方法；第四次免疫后三周和第五次免疫后第3-4天分别取少量血清，用蛋白质免疫印迹测定抗体效价，抗体效价在1:5000及以上的小鼠，在第五次免疫后9-10天取血并分离血清，获得小鼠多克隆抗体anti-EV-A71 VP1和anti-CV-A2 VP1。

7.权利要求4所述的基于人肠道病毒71型VP1重组蛋白的多克隆抗体及基于柯萨奇病毒A组2型VP1重组蛋白的多克隆抗体在制备人肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组2型特异性检测试剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的基于人肠道病毒71型VP1重组蛋白的多克隆抗体在制备人肠道病毒71型免疫印迹或免疫过氧化物酶单层细胞试验检测试剂中的应用以及基于柯萨奇病毒A组2型VP1重组蛋白的多克隆抗体在制备柯萨奇病毒A组2型免疫印迹或免疫过氧化物酶单层细胞试验检测试剂中的应用。