[发明专利]一种酿酒酵母表达长效重组纤连蛋白及其在化妆品中的应用

权利要求书

1.一种酿酒酵母表达长效重组纤连蛋白，其特征在于：所述长效重组纤连蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.1所示；

所述长效重组纤连蛋白包括FN的功能片段、HAS；所述FN的功能片段包括FNIII1C单元；所述FNIII1C单元为FN中第1个III型FN重复单元C端的一个功能片段。

2.如权利要求1所述的酿酒酵母表达长效重组纤连蛋白，其特征在于，所述长效重组纤连蛋白的获得方法包括以下步骤：

步骤一、目的基因的序列的设计：所述目的基因为FNIII1C-HAS基因，所述FNIII1C-HAS基因包括：Not I酶切位点、Xba I酶切位点、起始密码子、终止密码子、标签序列以及连接所述FNIII1C单元和HSA序列的Linker所对应的碱基序列；

步骤二、构建重组载体：首先根据目的基因的序列设计扩增引物，其次PCR扩增目的基因，之后进行重组载体的构建；

步骤三、构建工程菌：将重组载体和酿酒酵母INVScl感受态细胞按照10μl:80μl的比例混合均匀，然后转移到预冷的电击杯中；冰浴5min，擦干所述电击杯外壁；

将Bio-Rad电转化仪调至真菌档，所述电击杯置于所述Bio-Rad电转化仪上电击；迅速向所述电击杯中加入500μl预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，涂SC-U固体平板；

30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆；挑取转化子接种到SC-U液体培养基中，30℃、200rpm恒温培养；

以菌液为模板进行PCR反应，鉴定筛选阳性克隆；选取鉴定无误的转化子，获得工程菌INVSc1/pYES2/CT-MFα-rFNIII1C-HAS；

步骤四、工程菌的诱导表达：挑取工程菌单菌落接种于SC-U选择培养基，经30℃、220rpm震荡培养过夜。测定其OD_600nm吸光值，计算相应体积的菌液转接至于SC-U诱导培养基中，使得初始OD_600nm达到0.4，诱导时间为20h；

步骤五、长效重组纤连蛋白的纯化：离心收集培养液上清，用滤膜过滤用以上样；

使用镍离子螯合亲和层析填料自行装柱，获得镍离子螯合亲和层析柱，用纯化水清洗镍离子螯合亲和层析柱，再用PBS缓冲液平衡镍离子螯合亲和层析柱的pH值；

在线检测电导率值及280nm波长吸收值，待两者都稳定后开始上样，设置样品经过泵过层析柱的流速为5-6ml/min；再用PBS缓冲液过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到OD_280nm稳定；

再以含咪唑的PBS缓冲液过层析柱，洗脱并收集洗脱峰对应的蛋白，即得到长效重组纤连蛋白原液。

3.如权利要求2所述的酿酒酵母表达长效重组纤连蛋白，其特征在于，

所述扩增引物包括正向引物，所述正向引物的核苷酸序列如Seq ID NO.3所示；

所述扩增引物还包括反向引物，所述反向引物的核苷酸序列如Seq ID NO.4所示。

4.如权利要求2所述的酿酒酵母表达长效重组纤连蛋白，其特征在于，所述PCR扩增目的基因的PCR条件包括：

第一步、95℃预变性5min；

第二步、95℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸2.5min，共29个循环；72℃最终延伸10min，获得PCR扩增产物；

第三步、分离PCR扩增产物，切下目的条带，所述目的条带为目的基因PCR扩增产物；

第四步、回收所述目的基因PCR扩增产物。