[发明专利]一种能稳定表达ABEmax蛋白的细胞株及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种能稳定表达腺嘌呤碱基编辑器(ABEmax)蛋白的细胞株及其制备方法和应用，该方法利用Piggybac系统导入ABEmax蛋白表达基因和抗生素筛选基因到工具细胞293T细胞中，通过抗性筛选到流式筛选阳性单克隆细胞株，最终得到能够稳定表达ABEmax蛋白的细胞株。本发明构建的细胞株是基于Piggybac转座子构成的载体‑辅助质粒系统、同源重组原理构建的。构建的293T工具细胞系含有嘌呤抗性，后续编辑过程中guide RNA需要设计连接到荧光质粒或其他非嘌呤霉素抗性质粒中便于筛选实验。本发明获得的这种工具细胞极大的简化了碱基编辑过程中细胞转染过程，为碱基编辑的推广应用奠定基础。

技术领域

本发明涉及一种稳定表达ABEmax基因的工具细胞293T细胞株及其制备方法与应用。属于基因工程领域。

背景技术

基因编辑技术是利用人工核酸酶对基因组进行靶向修饰的遗传工程技术，是当今生命科学领域的研究热点。CRISPR/Cas9基因编辑系统虽然提高了基因敲除及定点修饰(包括定点突变及基因插入等)的效率，但是仍然存在一定的不足：同源介导修复(homology-directed repair,HDR)的低编辑效率。与非同源末端连接(non-homologous End Joining,NHEJ)相比，HDR以相对低的频率发生，并且在非分裂细胞中，这个修复机制会进一步遭受下调。

碱基编辑技术(base editing)是基于CRISPR/Cas系统所发展起来的一种新型基因修饰技术，根据碱基修饰酶的不同可分为胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor,CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor,ABE)。这两种碱基编辑系统利用胞嘧啶脱氨酶或人工进化的腺嘌呤脱氨酶对基因的靶位点进行精准的碱基编辑，最终可以分别实现C-T(G-A)或A-G(T-C)的碱基替换。碱基编辑技术自从被开发以来，因其高效、不依赖DNA双链断裂的产生、无需供体DNA参与等诸多优势，已经成功地应用在多种动物、植物和其他生物中，为基因治疗等领域提供了重要技术支撑。

由于碱基编辑系统编码基因比较大，整个编辑系统质粒长度超过8000bp，在进行碱基编辑时，可能会因质粒过大影响细胞的转染效率和编辑效率，使得构建基因编辑细胞系的成功率大为下降。因此，开发一种能够稳定表达碱基编辑系统的细胞系具有十分重要的意义。

发明内容

本发明旨在解决目前因碱基编辑系统较大影响转染效率和编辑效率的技术问题。为此，本发明提出一种能稳定表达ABEmax这种腺嘌呤碱基编辑器的细胞株的制备方法，该方法能够通过PiggyBac转座系统将ABEmax的编码基因插入到工具细胞293T中并稳定表达。

本发明还提出一种使用上述制备方法制备得到的细胞株。

本发明还提出了这种细胞株的应用。

根据本发明实施例的稳定表达ABEmax编辑器的细胞株的制备方法，包括以下步骤：

S1、设计并构建能表达ABEmax基因、抗生素筛选标记的piggyBac载体；

S2、将所述piggyBac载体和转座酶基因载体共转入工具细胞293T细胞，通过抗生素筛选阳性细胞株并对筛选出的阳性细胞株进行编辑效果鉴定；

S3、将所述有编辑效果的细胞株经过抗生素筛选后流式分选单克隆细胞系；

S4、单克隆细胞经过PCR验证和编辑效果验证后即得稳定表达ABEmax蛋白的细胞株。