[发明专利]基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型及其构建与应用

说明书

本发明涉及一种基于Nsupgt;6/supgt;‑甲基腺嘌呤(Nsupgt;6/supgt;‑methyladenosin，msupgt;6/supgt;A)水平的化合物筛选细胞模型，以及该模型的构建及应用。利用RNA‑msupgt;6/supgt;A甲基化修饰调控RNA稳定性的原理，首先使用基因工程技术构建携带msupgt;6/supgt;A修饰基序的表达载体，进一步利用该载体构建能够反映msupgt;6/supgt;A修饰水平的细胞模型，最终通过细胞荧光强度差异计算化合物对msupgt;6/supgt;A修饰水平的影响。此细胞筛选模型相较于荧光定量PCR、蛋白免疫印迹等检测方法，具有操作简单、通量高、灵敏度强的优势。

技术领域

本发明涉及一种基于N⁶-甲基腺嘌呤(N⁶-methyladenosin，m⁶A)修饰水平的化合物筛选细胞模型，以及该模型的构建及应用。

背景技术

m⁶A是RNA上含量最丰富的化学修饰，在病毒、细菌、酵母、植物和哺乳动物中普遍存在。其受甲基转移酶、去甲基化酶及识别蛋白共同调控，主要分布在mRNA的3’非翻译区(untanslated region，UTR)，核心基序为RRACH(R，嘌呤；H，非鸟嘌呤碱基)。研究结果显示，m⁶A通过调节mRNA的降解、翻译、可变剪切以及mRNA的细胞定位等角度影响mRNA的功能与命运，在生理及病理过程中发挥了重要作用。

近年的多个研究结果显示m⁶A修饰水平能够调控肿瘤干细胞的自我更新以及致瘤能力；m⁶A相关蛋白的异常表达与肿瘤的发展、转移、耐药性、不良预后及复发显著相关。例如，肥胖相关基因(Fat mass and obesity associated，FTO)作为m⁶A去甲基化酶，在急性髓细胞性白血病(Acute myeloid leukemia，AML)中起着至关重要的致癌作用。FTO通过降低mRNA转录物中的m⁶A水平来调节靶基因的表达，从而增强白血病致癌基因所介导的细胞转化和白血病发生。另一方面，也有研究证明类甲基转移酶3(Methyltransferase like3，METTL3)及类甲基转移酶14(Methyltransferase like 14，METTL14)在正常骨髓生成和AML发病机制中起着关键作用。除此之外，有研究证明m⁶A修饰在阿尔兹海默症、肥胖、2-型糖尿病、肝细胞癌等疾病具有重要作用。由此可见，m⁶A修饰及其调控蛋白是重要的疾病治疗的新靶点，针对该修饰的药物筛选模型的开发具有重要的实践意义和社会价值。

目前已发现并鉴定的m⁶A抑制剂或激活剂较少，灵敏且高效的的m⁶A相关化合物筛选模型的建立将有助于化合物的开发。因此，急需开发一种基于m⁶A修饰水平的化合物筛选细胞模型。

发明内容

本发明针对该问题，利用m⁶A调控转录本稳定性的原理，开发了基于m⁶A修饰水平的化合物筛选细胞模型，模型示意图如图1所示。本发明基因工程技术构建了可表达富含m⁶A修饰转录本的荧光蛋白表达载体。我们首先选取转录本3’UTR区域富含m⁶A位点且易受YTHm⁶A结合蛋白2(YTH N⁶-methyladenosine RNA binding protein 2，YTHDF2)识别的基因序列；进一步将其构建在增强型绿色荧光蛋白基因(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)的3’UTR区域；利用YTHDF2蛋白识别m⁶A修饰调控转录本稳定性的原理，调节EGFP表达水平，最终在细胞水平通过荧光强度的变化来反映EGFP基因的3’UTR区域上的m⁶A水平的变化。通过该模型，可以快速高效地对化合物进行筛选，获得调控m⁶A水平的化合物。