[发明专利]基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型及其构建与应用有效
申请号: | 202110353356.3 | 申请日: | 2021-04-01 |
公开(公告)号: | CN112899238B | 公开(公告)日: | 2023-09-26 |
发明(设计)人: | 周君;刘晓敏;甘衔清;王申 | 申请(专利权)人: | 中国药科大学 |
主分类号: | C12N5/10 | 分类号: | C12N5/10;C12N15/85;C12N15/113;C12N15/65;C12N15/66;C12Q1/02;G01N21/64 |
代理公司: | 南京天华专利代理有限责任公司 32218 | 代理人: | 竞存;徐冬涛 |
地址: | 210009*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 基于 rna m6a 修饰 水平 化合物 筛选 细胞 模型 及其 构建 应用 | ||
1.一种基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型的构建方法,其特征在于,所述构建方法包括以下步骤:
(1)构建携带m6A修饰基序的表达载体:将ADGRE5基因的3’ UTR区域插入EGFP-C1报告载体的EGFP序列后的多克隆位点中,获得携带m6A修饰基序的表达载体;
(2)构建基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型:将(1)构建的携带m6A修饰基序的表达载体转染HEK-293细胞,用G418硫酸盐筛选具有新霉素抗性的细胞株,再通过稀释法获取筛选模型单克隆细胞株,所述单克隆细胞株即基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型;
步骤(1)中所述ADGRE5的3’ UTR区域序列是以HEK-293细胞的cDNA为模板,通过PCR技术,使用特异性引物扩增得到的;所述特异性引物为:
hADGRE5-F:5’- GGAATTCGGCATCAGAGTCCGGCAT-3’,
hADGRE5-R:5’- CGCGGATCCACAACGTCTACAACCTTCAC-3’;
步骤(1)中所述ADGRE5基因的3’UTR区域核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示,所述携带m6A修饰基序的表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。
2.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述步骤(1)具体操作为:
(1-1)采用EGFP-C1载体序列上的BamH I和EcoR I多克隆位点,并用BamH I和EcoR I限制性内切酶对扩增后的ADGRE5基因片段两端进行双酶切,获得具BamH I和EcoR I粘性末端的ADGRE5基因的3’ UTR片段;
(1-2)用BamH I和EcoR I限制性内切酶对EGFP-C1载体进行双酶切,回收EGFP-C1载体酶切产物;
(1-3)连接扩增产物和EGFP-C1载体酶切产物,获得携带m6A修饰基序的表达载体。
3.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,步骤(2)的具体操作为:
(2-1)转染HEK-293细胞:取两份等量的Opti-MEM培养基,一份与(1)构建的携带m6A修饰基序的表达载体以5 μg/ml的浓度混合,另一份与Lipofectamine 2000以10 μl /μl的浓度混合,将两份混合产物充分混匀,加入贴壁培养HEK-293细胞的细胞培养皿中转染4小时,换成体积百分比为10 %的胎牛血清的完全DMEM培养基继续培养,36-48小时后观察细胞荧光;
(2-2)用G418硫酸盐进行细胞筛选:在转染HEK-293细胞48小时后加入含800 ng/μlG418硫酸盐溶液的完全培养基,连续筛选至细胞不发生大量死亡;
(2-3)获取单克隆细胞:将(2-2)中的含800 ng/μl G418硫酸盐溶液的完全培养基换成含400 ng/μl G418硫酸盐溶液的完全培养基进行培养,将细胞株用培养基稀释并种到96孔细胞培养盘中,确保每孔仅含有1个细胞,待培养两周后,单个细胞长至一团细胞,将具有荧光的单克隆扩大培养并保存,即为筛选模型的单克隆细胞株。
4.一种基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型,其特征在于,所述基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型是通过权利要求1至3任一项权利要求所述的构建方法构建得到的。
5.权利要求4所述的基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型在筛选影响m6A修饰水平的化合物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,将待筛选化合物与所述细胞模型混合后,检测细胞荧光强度,如细胞荧光强度有变化,则所述待筛选化合物为对m6A修饰水平有影响的化合物。
7.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述应用包括以下步骤:
向细胞培养皿中加入DMEM培养基,所述DMEM培养基的加入量为1.5 ml DMEM培养基/3.5 cm细胞培养皿,将所述基于RNA-m6A修饰水平的化合物筛选细胞模型以4×105个细胞/3.5 cm细胞培养皿的比例接种,培养至细胞汇合度达到60 %;
向培养基中加入待筛选化合物,所述待筛选化合物的加入量为0.1-1.5 μl/3.5 cm细胞培养皿,继续培养40小时;
培养结束后,收集细胞并使用PBS缓冲液清洗,再加入200 μl RIPA细胞裂解液,裂解15分钟后,加入RIPA裂解液两倍体积的50 mM Tris-Hcl,充分混匀,所述50 mM Tris-Hcl 的pH=10.0;
按照每孔80 μl体积将步骤(3)的混合产物加入到无盖的96孔酶标板中,采用酶标仪对酶标板进行数据采集,通用检测波长为激发波长479 nm,发射波长520 nm。
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