[发明专利]一种硫代寡核苷酸的制备方法

说明书

本发明提供一种硫代寡核苷酸的制备方法，采用固相亚磷酸酰胺三酯法将核苷酸单体按设定的碱基序列，从3′端到5′端的顺序依次进行连接，最后形成以3′,5′‑硫代磷酸二酯键连接起来的寡核苷酸片段，其中，以交联聚苯乙烯珠为固相载体。本发明针对硫代寡核苷酸YK102的特点，对现有合成工艺进行改进，采用本发明所述的制备方法可以显著提高YK102的收率，为高产率制备治疗肿瘤疾病的反义寡核苷酸提供技术支持。

技术领域

本发明涉及核酸合成技术领域，尤其涉及一种硫代寡核苷酸的制备方法。

背景技术

寡核苷酸，是一类只有30个以下碱基的短链核苷酸的总称(包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA内的核苷酸)，因其易与它们的互补链对接，抑制RNA片段，防止其翻译成蛋白，在治疗癌症等疾病过程中具有积极的意义。

反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides，ASO)是靶向调节IGF1R信号通路的方法之一，其可与靶mRNA的特定序列互补结合形成双链，从而激活RNase H降解mRNA或阻止蛋白翻译的起始，起到抑制目标基因表达的作用，迄今为止，国际上已有两个反义核酸类药物被批准上市(Vitravene^TM和)。

对于核酸类药物的合成，在50-60年代由霍拉纳(Khorana)发展起来的DNA合成是在溶液中进行的，这种液相合成的方法周期长，偶联产率低，每次偶联后都要对中间产物进行纯化，合成的方法复杂。70年代，Itakura借鉴多肽的固相合成技术发展了DNA的固相合成。固相合成是将待合成的DNA链的3'端的第一个核苷酸与一种高分子材料的固相载体定向连接(3'端连接到固相载体上)；用脱保护剂脱去该核苷酸5'端的保护基团，将第二个待连接的核苷酸用四唑活化后，其3'端磷酸基与第一个核苷酸的5'端羟基偶联，相连的两个核苷酸间形成磷酸(或亚磷酸)三酯键。固相合成法的优点在于偶联效率高、合成产物易于分离纯化、最终产率高且整个操作过程非常简化、易于掌握。

固相合成法分为磷酸三酯法和亚磷酸三酯法。磷酸三酯法是由液相三酯法发展起来的，每次偶联反应时间长达15分钟到2小时，不能满足迅速大量合成的需要，且连接产率也只能达到95％。亚磷酸三酯法根据亚磷酸基团结合的反应性基团的不同，可分为氯亚磷酸三酯法和二异丙基酰胺亚磷酸三酯法。由于氯亚磷酸衍生物本身的不稳定性，使氯亚磷酸三酯法的应用受到限制。二异丙基亚磷酸酰胺法，也称亚磷酸酰胺法或亚磷酸酰胺三酯法，是亚磷酸三酯法中更现代的方法。二异丙基胺与亚磷酸基团结合形成二异丙基亚磷酸酰胺化合物。此功能基团本身并不与羟基发生反应，但在弱酸条件下，如四唑存在下，转化为亚磷酸酰胺四唑的活性中间体，该活性中间体能与另一核苷酸的5'-羟基反应，偶联效率比较高。

有关YK102的合成工艺的文献报道非常少，而我们在制备此产品的过程中发现，现有合成方法存在终产品收率偏低的问题。因此，其合成工艺需进行深入研究。

发明内容

为了克服上述技术问题，本发明提供一种硫代寡核苷酸的制备方法，采用本发明所述方法能够显著提高终产品的收率。

本发明所述的硫代寡核苷酸的制备方法，采用固相亚磷酸酰胺三酯法将核苷酸单体按设定的碱基序列，从3′端到5′端的顺序依次进行连接，最后形成以3′,5′-硫代磷酸二酯键连接的寡核苷酸片段，其中，以交联聚苯乙烯珠为固相载体。

发明人通过大量实践发现，初始核苷酸通过功能基偶联的方式更有利于固载在上述特定的固相载体表面，从而有利于提高终产品的收率。

在一些具体的实施例中，所述固相亚磷酸酰胺三酯法的氨解步骤中使用的氨解试剂为浓度25～28％的氨水，所述氨水的用量为核苷酸单体总重量的0.5～2.5倍，氨解温度为58～90℃。