[发明专利]一种硫代寡核苷酸的制备方法

权利要求书

1.一种硫代寡核苷酸的制备方法，其特征在于，采用固相亚磷酸酰胺三酯法将核苷酸单体按设定的碱基序列，从3′端到5′端的顺序依次进行连接，最后形成以3′,5′-硫代磷酸二酯键连接的寡核苷酸片段，其中，以交联聚苯乙烯珠为固相载体；

所述固相亚磷酸酰胺三酯法包括：

将核苷酸单体在使用前先用乙腈配制成核苷酸溶液；

脱除初始核苷酸C5′-羟基的DMT保护基，所述初始核苷酸预先连接负载在固相载体上；

重复加入C3′-羟基经亚磷酰胺修饰，C5′-羟基被DMT保护的核苷酸单体进行偶联，氧化，羟基保护，脱除DMT保护基的步骤，将核苷酸单体依次连接到所述固相载体的核苷酸上；在所述脱除DMT保护基、偶联、氧化、羟基保护的每一步骤结束后，用乙腈进行冲洗；所述乙腈的水分限量为0-50ppm；

对上述合成产物进行氨解，得到序列长度为15~30个碱基的所述硫代寡核苷酸；

所述氨解的氨解试剂为浓度25~28%的氨水，所述氨水的用量为核苷酸单体总重量的0.8~1.6倍，氨解温度为58~90℃。

2.根据权利要求1所述的硫代寡核苷酸的制备方法，其特征在于，所述氨水的用量为核苷酸单体总重量的0.8~1.6倍，反应温度为60~75℃。

3.根据权利要求1所述的硫代寡核苷酸的制备方法，其特征在于，所述硫代寡核苷酸的序列长度为20个碱基。

4.根据权利要求3所述的硫代寡核苷酸的制备方法，其特征在于，所述硫代寡核苷酸的碱基序列为：

5′-TCCTCCGGAGCCAGACTTCA-3′。

5.根据权利要求1所述的硫代寡核苷酸的制备方法，其特征在于，所述乙腈的水分限量为5-25ppm。

6.根据权利要求1所述的硫代寡核苷酸的制备方法，其特征在于，所述核苷酸单体包括DMT-dA（bz）亚磷酰胺单体、DMT-dC（bz）亚磷酰胺单体、DMT-dG（ib）亚磷酰胺单体和DMT-dT亚磷酰胺单体。

7.根据权利要求6所述的硫代寡核苷酸的制备方法，其特征在于，所述脱除DMT保护基的步骤中使用的脱保护试剂为1~5w/v%的二氯乙酸的甲苯溶液、二氯乙酸的二氯甲烷溶液或二氯乙酸的甲醇溶液。

8.根据权利要求7所述的硫代寡核苷酸的制备方法，其特征在于，所述脱除DMT保护基的步骤中使用的脱保护试剂为3w/v%的二氯乙酸的甲苯溶液。

9.根据权利要求6所述的硫代寡核苷酸的制备方法，其特征在于，所述偶联的步骤中使用5-乙硫基四氮唑作为活化剂；

或所述氧化的步骤中使用氢化黄原素作为氧化剂；

或所述羟基保护的步骤中使用乙酸酐作为保护剂。