[发明专利]一种能产生抗卡痛单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种能产生抗卡痛单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：其命名为杂交瘤细胞株Kratom 11B7，已于2021年1月31日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏号为CCTCCNO：C202146。

2.一种如权利要求1所述杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤1：帽柱木碱完全抗原的制备：以帽柱木碱为原料，先用三氟乙酸酐保护仲胺基，再用氢氧化锂水解甲酯得到羧基，在羧基位点引入5-氨基戊酸增加臂长，得到帽柱木碱半抗原，通过碳二亚胺法使帽柱木碱半抗原偶联载体蛋白后，脱去保护基，得到帽柱木碱完全抗原；

步骤2：7羟基帽柱木碱完全抗原的制备：以7羟基帽柱木碱为原料，用氢氧化锂水解甲酯得到羧基，在羧基位点引入5-氨基戊酸增加臂长，得到7羟基帽柱木碱半抗原，通过碳二亚胺法使7羟基帽柱木碱半抗原偶联载体蛋白后，得到7羟基帽柱木碱完全抗原；

步骤3：杂交瘤细胞株的制备：用帽柱木碱完全抗原和7羟基帽柱木碱完全抗原共同免疫小鼠，得到杂交瘤细胞株Kratom11B7。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤3中，所述杂交瘤细胞株通过皮下免疫、静脉免疫结合的连续增强刺激免疫方法获得。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤3包括：

步骤3.1：免疫；

步骤3.2：脾细胞与骨髓瘤细胞的融合；

步骤3.3：杂交瘤细胞的筛选。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤3.1具体为：

将帽柱木碱完全抗原和7羟基帽柱木碱完全抗原按质量比（0.8-1.2）:1混合，然后用PBS缓冲液稀释浓度为0.8-1.2mg/ml；第1天免疫再将稀释后的抗原和完全佐剂按质量比（0.8-1.2）:1混合，在小鼠皮下注射3-7ug/只，第6天用不完全佐剂混合抗原，在小鼠淋巴结附近注射8-12ug/只，第11天在小鼠淋巴结附近注射13-17ug/只，第16天在小鼠淋巴结附近注射18-22ug/只，第21天在小鼠淋巴结附近注射23-27ug/只，第24天在小鼠静脉直接注射3-7ug/只。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤3.2具体为：

步骤3.2.1：饲养细胞悬液制备：小鼠摘眼球放血处死，浸泡于酒精中消毒，撕开小鼠腹外皮肤，暴露其腹膜，注入35-40℃预热的DMEM无血清培养基，轻揉小鼠腹腔1-2分钟，悬浮腹腔细胞，吸出腹腔液；剪开小鼠胸腔取胸腺研磨后收集悬液，与腹腔液合并离心，沉淀物用HAT完全培养液重悬，得到饲养细胞悬液；

步骤3.2.2：小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：把小鼠骨髓瘤细胞SP2/0用含体积分数为8-12﹪FBS的DMEM培养基进行传代培养，细胞融合前一天进行传代以保证小鼠骨髓瘤细胞SP2/0适合生长对数期，生长状态良好用于细胞融合；

步骤3.2.3：脾细胞制备：将上述免疫的小鼠处死，泡酒精中消毒后剖腹，无菌取出脾脏，将脾脏放在连接着离心管的滤网上，立即加入无血清的DMEM培养液，用眼科剪剪碎脾脏，然后用无菌注射器柄轻磨脾脏，使脾脏细胞经过网孔滤入离心管内，加无血清培养液，离心；弃上清用无血清培养液重复离心，待用；

步骤3.2.4：脾细胞与骨髓瘤细胞融合：将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合均匀，离心洗涤细胞，去除上清液，置于35-40℃水浴，加入0.5-1.0ml35-40℃预温的PEG4000，一分钟内加完，然后静止80-100秒；再加入20-30ml35-40℃预温的DMEM无血清培养液终止PEG作用；离心，取沉淀；然后在沉淀中加入饲养细胞悬液，接种到96孔细胞培养板中，置于35-40℃，3-7﹪CO₂培养箱中培养；20-30小时后，采用HAT培养基，HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液，获得融合细胞。